猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋白的初步应用

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wilson_rui
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本文利用不同大肠杆菌表达系统(所用表达载体分别为:pThioHisB和pET-32a(+))表达了猪瘟兔化弱毒编码E2蛋白A/D抗原区的基因,并对其表达特性进行了比较。选取含pET-E2HA重组质粒的BL21(DE3),即BL21E2HA大量表达重组蛋白,通过盐酸胍溶解,通过His Bind柱纯化了重组蛋白,定量并以其为包被抗原建立了间接ELISA方法。利用此方法测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平;比较了此方法和间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平的灵敏度。主要实验内容包括: 1.构建了两株重组质粒:pTH-E2和pET-E2,所用表达系统分别为pThioHisB和pET-32a(+),优化了表达条件并比较了两种质粒的表达特性,发现pET系统在表达此段基因时产量明显优于pThioHisB系统; 2.选择pET-E2进行后继工作:将3个串联的HA(人血凝素表位)基因插入到pET-E2重组质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,得到pET-E2HA重组质粒,含有此质粒的BL21(DE3)命名为BL21E2HA,并将其成功的表达; 3.利用BL21E2HA大量表达重组蛋白,将细菌裂解,超声波破碎、离心分离包涵体,盐酸胍溶解后过His Bind柱,纯化了重组蛋白; 4.利用BSA制备标准曲线,并对处于不可溶状态的纯化后重组蛋白进行了定量。在此基础上,用其作包被抗原建立了间接ELISA方法;利用此间接ELISA方法,测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平,发现经囊素共同免疫后,猪瘟抗体水平有明显提高,这从另一方面证明,该方法具有一定的实用价值,可以进行猪瘟抗体水平的测定; 5.比较了间接ELISA方法和现有的间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平时的灵敏度,发现该方法明显优于后者。 6.构建了一个用以检测在细胞培养上猪瘟病毒粒子存在的重组质粒。
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