研究背景高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病,它具有暴发突然、感染性强、病程进展迅速和死亡率高的特点,一旦大面积暴发往往会伴随巨大经济损失。当前针对H7N9、H5N1等高致病性禽流感病毒感染检测与确诊的主要手段是逆转录聚合酶链式反应技术,此技术存在高成本、操作复杂和需要受过专业技术培训人员等要求,样本需要经过采集、集中、提纯等处理程序,增加了病毒扩散的几率,延长了获得检测结果的时间,往往需要一天以上才能得到检测结果。现存检测方法无论是血清学检测技术还是分子生物学检测技术,在应对当前禽流感集中暴发与长期散发交替、大量隐性感染与少数发病感染并存、易感人群普通市民和偏远乡村居民并存的疫情现状时有些滞后和困难,往往造成疫情拖延和治疗延误,甚至引燃疫情爆发。因此,研发一种操作简便、检测快速、价格相对低廉的检测高致病性禽流感病毒的方法具有非常重要的现实意义。研究目的本课题组拟研发一种高致病禽流感病毒快速检测便携式诊断试剂盒,涉及高致病性禽流感病毒捕获、滚环扩增、自生成引物滚环扩增和可视化显色等关键技术。本研究以滚环扩增技术为基础,探索自生成引物滚环扩增的快速扩增方法,利用金属指示剂可视化检测扩增结果,为研发一种能够针对高致病禽流感病毒快速检测的方法奠定基础。研究方法（1）基于锁式探针的恒温滚环扩增方法,检测禽流感病毒特征基因序列。（2）基于自生成引物滚环扩增方法,检测禽流感病毒特征基因序列。（3）DNA扩增会伴随产生焦磷酸,镁离子与焦磷酸结合沉淀导致镁离子浓度下降,金属指示剂羟基萘酚蓝随镁离子浓度变化会发生颜色变化,可直接肉眼观测其反应结果,使扩增产物的检测成为可视化检测,实现可视化检测扩增结果。（4）采用石英晶体微天平和凝胶阻滞实验验证适体与H5N1病毒疫苗和重组H5N1 HA蛋白的结合力。研究结果（1）成功建立基于锁式探针的恒温滚环扩增检测技术,并且探索了最佳成环条件和最佳扩增条件,确定了采用T4 DNA连接酶连接体系,成环的序列浓度为250 nM。扩增采用bst DNA聚合酶扩增体系,并且确定了用3μL的模板环65℃扩增1 h,整个基于锁式探针的滚环扩增检测操作可控制在3 h内完成。（2）在滚环扩增基础上设计自生成引物滚环扩增,两条序列自生成引物的设计通过琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示阴性和阳性对照表现出显著的差异性。（3）成功建立可视化检测方法,利用金属指示剂羟基萘酚蓝可明显区分出体系有无扩增反应,即存在扩增反应则显示蓝色,无扩增反应显示紫色,并且对显色条件进行了优化,确定8 mM的Mg²⁺和1.6 mM的dNTP是羟基萘酚蓝显色最适起始浓度,在pH 9条件下能明显区分有无扩增反应的发生。（4）通过磁珠-单适体和磁珠-双适体两种捕获禽流感病毒的方式,以及滚环扩增和自生成引物滚环扩增两种扩增方式的结合,设计了4种检测禽流感病毒的方案,且对适体和病毒的结合能力进行了初步探索分析,但是目前并没有发现合适适体。结论本论文利用恒温滚环扩增检测禽流感病毒特征基因序列,并在滚环扩增的基础上,设计了自生成引物滚环扩增的方法,利用羟基萘酚蓝金属指示剂,直接观测扩增反应结果,使扩增产物的检测成为可视化检测,目前已建立出四种检测禽流感病毒的方法,即方案一:磁珠-单适体捕获禽流感病毒,释放特征基因序列利用滚环扩增实现信号扩大;方案二:磁珠-单适体捕获禽流感病毒,释放特征基因序列利用自生成引物滚环扩增实现信号扩大;方案三:磁珠-双适体捕获禽流感病毒,利用滚环扩增适体2实现信号扩大;方案四:磁珠-双适体捕获禽流感病毒,利用自生成引物滚环扩增适体2实现信号扩大。