【摘 要】
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目的:构建过表达昼夜节律基因Bmal1腺病毒载体,体外转染巨噬细胞。采用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)刺激巨噬细胞,观察并评价对巨噬细胞泡沫化程度、迁移、炎症、凋亡的变化。方法:(1)选取小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象。分为Control组(空白对照组)、ox-LDL组(50μg/mL ox-LDL干预组)、Ad-GFP
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目的:构建过表达昼夜节律基因Bmal1腺病毒载体,体外转染巨噬细胞。采用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)刺激巨噬细胞,观察并评价对巨噬细胞泡沫化程度、迁移、炎症、凋亡的变化。方法:(1)选取小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象。分为Control组(空白对照组)、ox-LDL组(50μg/mL ox-LDL干预组)、Ad-GFP+ox-LDL组(空载腺病毒转染3天+50μg/mL ox-LDL干预组)和Ad-Bmal1+ox-LDL组(Bmal1腺病毒转染3天+50μg/mL ox-LDL干预组)。(2)荧光显微镜观察RAW264.7中腺病毒转染效率。(3)油红O染色检测不同昼夜节律时间点(0 h、6 h、12 h、24 h)RAW264.7细胞泡沫化程度。(4)Transwell小室法及划痕实验检测RAW264.7细胞的迁移。(5)流式细胞仪检测RAW264.7细胞的凋亡。(6)q RT-PCR检测Bmal1、IL6、IL10、Bax、Mcl1 m RNA的表达。(7)Western-Blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达水平。结果:(1)荧光显微镜下可见Ad-GFP+ox-LDL组和Ad-Bmal1+ox-LDL组表达明显的绿色荧光蛋白,表明重组腺病毒在体外转染效率高;Ad-Bmal1转染72 h后,Bmal1m RNA表达明显升高,表明Ad-Bmal1可以有效诱导Bmal1过表达。(2)油红O染色示:ox-LDL刺激6 h、12 h、24 h后,细胞内均可见明显的脂滴,且呈时间依赖性,脂滴面积在24 h时达到最大值。12 h、24 h组分别与0 h、6 h组相比细胞内脂滴面积增加(P<0.05)。(3)Transwell小室法及划痕实验检测示:50μg/mL ox-LDL可刺激正常的细胞发生明显迁移;但Ad-GFP、Ad-Bmal1对迁移无明显抑制作用。(4)流式细胞术检测示:与Control组相比,ox-LDL组细胞的凋亡比例增加(P<0.05);与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞的凋亡比例减少(P<0.05)。(5)在ox-LDL刺激12 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞IL6 m RNA的表达水平下降,IL10 m RNA的表达水平上升(P<0.05)。(6)在ox-LDL刺激24 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞Bax m RNA的表达水平下降,Mcl1 m RNA的表达水平上升(P<0.05)。(7)在ox-LDL刺激6、12 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞pre-caspase3、pre-caspase9的蛋白表达水平下降(P<0.05)。(8)在ox-LDL刺激6、12、24 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞cleaved-caspase3的蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:过表达昼夜节律基因Bmal1可以抑制ox-LDL刺激下巨噬细胞的炎症反应及凋亡效应,为探索昼夜节律在动脉粥样硬化中作用提供实验依据。
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