研究背景转移是一个复杂的多步骤过程,卵巢癌极易发生盆腹腔内侵袭播散转移,因此,如何更好地抑制癌细胞侵袭、转移成为卵巢癌临床治疗和基础研究的热点和难点。上皮间质转化,即上皮细胞从有极性的上皮表型转变为高度运动性的纤维母细胞样或间叶性表型,在早期胚胎发生中发挥重要作用。体外及体内研究均表明,上皮间质转化在上皮性肿瘤的浸润播散过程中发挥作用,上皮间质转化机制在上皮性肿瘤的进展、浸润、侵袭转移中得以激活,是上皮来源的肿瘤细胞获得侵袭性的关键分子事件,在恶性肿瘤的发展及转移播散过程中发挥主要的病理作用。生化方面,细胞上皮性标志物如E-cadherin的表达转变为间质性标志物如N-cadherin的表达为标志。Twist基因最初在果蝇的胚胎发育研究中发现,可调节细胞移动和组织重建,诱导中胚层发育。目前研究证实Twist基因与上皮间质转化现象及肿瘤转移密切相关,是上皮间质转化过程的关键调控因子,在肿瘤的侵袭转移过程中起重要的作用。目前有关Twist在卵巢癌的发生、发展及上皮间质转化、侵袭转移中的作用尚无深入研究。本课题分两部分内容来研究Twist基因在卵巢癌发生、发展及上皮间质转化、侵袭转移中的作用。第一部分研究目的检测卵巢癌组织中Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白和mRNA的表达,探讨Twist与卵巢癌临床病理特征的关系,及其与E-cadherin和N-cadherin表达相关性。研究方法1.采用免疫组化方法检测54例卵巢癌组织和54例正常卵巢组织中Twist、上皮性标记基因E-cadherin及间质性标记基因N-cadherin蛋白的表达,比较卵巢癌组织和正常卵巢组织中这三个指标的表达情况；分析Twist、 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达与卵巢癌临床分期、分化程度及淋巴结转移的相关性；分析卵巢癌组织中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达与Twist蛋白表达的相关性。2.采用RT-PCR法检测54例卵巢癌组织和54例正常卵巢组织中Twist、E-cadherin和N-cadherin mRNA的表达,比较卵巢癌组织和正常卵巢组织中的Twist、E-cadherin、N-cadherin mRNA的表达情况。结果1.卵巢癌组织中Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白阳性表达率分别为68.5%、27.8%和48.1%,正常卵巢组织分别为25.9%、85.2%和14.8%,这三个指标在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达,差异均有统计学意义(P均<0.05)。2.中低分化、晚期、有淋巴结转移的卵巢癌组织中Twist表达高于高分化、早期、无淋巴结转移的卵巢癌；中低分化、晚期、有淋巴结转移的卵巢癌组织中E-cadherin表达低于高分化、早期、无淋巴结转移卵巢癌；中低分化、晚期、有淋巴结转移的卵巢癌组织中N-cadherin的表达高于高分化、早期、无淋巴结转移的卵巢癌,差别有统计学意义(P均<0.05)。3.Twist、E-cadherin及N-cadherin mRNA在卵巢癌组织中的表达量(光密度比值)分别为,1.49±0.53、0.82±0.24、1.55±0.56。正常卵巢组织中,分别为1.14±0.38、1.08±0.19、1.14±0.32。上述各项指标在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达相比,差异均有统计学意义,P均<0.05。4.卵巢癌组织中,37例Twist表达阳性的卵巢癌组织中E-cadherin表达缺失者33例；而在Twist阴性表达的17例卵巢癌组织中E-cadherin表达缺失达者6例,相关分析结果提示卵巢组织中E-cadherin的表达与Twist表达呈负相关,r=-0.56。37例Twist表达阳性的卵巢癌组织中N-cadherin表达阳性者23例；而在17例Twist表达阴性的卵巢癌组织中,有3例N-cadherin表达阳性,相关分析结果提示卵巢癌组织中N-cadherin表达与Twist表达呈正相关,r=0.41。结论1.在卵巢癌组织中,Twist蛋白和mRAN表达上调,提示Twist基因与卵巢癌的发生有关；2.卵巢癌组织中Twist表达上调的同时,上皮性标记E-cadherin表达下调,同时间质性标志N-cadherin表达上调,提示Twist可能与卵巢癌中的上皮间质转化有关。3.卵巢癌组织中Twist、N-cadherin高表达和E-cadherin低表达与卵巢的期别晚、分化程度差及淋巴结转移有关,提示Twist及与其可能相关的上皮间质转化与卵巢癌的进展有关。意义应用免疫组化和RT-PCR方法检测了卵巢癌组织中Twist、E-cadherin和N-cadherin蛋白和mRNA的表达,为进一步研究Twist与卵巢癌侵袭转移及上皮间质转化的关系奠定了基础。研究目的应用RNA干扰(RNAinterference, RNAi)技术,沉默Twist基因,观察卵巢癌细胞体外增殖、侵袭、粘附特性的变化以及上皮性标记E-cadherin、间质性标志N-cadherin表达的改变,探讨Twist基因在卵巢癌上皮间质转化过程中的作用。研究方法1.利用pGenesil2真核表达载体构建两对含高效的靶向Twist基因的重组载体pGenesil2-Twist shRNA1和pGenesil2-Twist shRNA2,并对重组载体进行酶切鉴定和测序。2.将pGenesil-2Twist shRNA质粒转染人卵巢癌A2780细胞,转染后24h、48h和72h收集细胞用荧光显微镜分别测定转染效率和观察转染情况。根据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表达后发绿色荧光的特点,在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,计算质粒转染效率。3.采用Western-blot方法分别检测正常对照组,阴性对照组(本质粒中插入的片段与干扰质粒的干扰片段碱基构成相同,而顺序不同,且与基因库中没有任何同源序列),和Twist shRNA质粒转染组细胞中Twist蛋白的表达情况,分析转染pGenesil-2Twist shRNA质粒后人卵巢癌A2780细胞Twist蛋白表达的变化。4.采用RT-PCR方法检测正常对照组,阴性对照组,和Twist shRNA质粒转染组细胞Twist mRNA的表达情况,分析转染pGenesil-2Twist shRNA质粒后人卵巢癌A2780细胞TwistmRNA表达的变化。5.采用MTT法检测Twist shRNA质粒转染后人卵巢癌A2780细胞与正常对照组、阴性对照组的卵巢癌细胞的的增殖情况,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞增殖能力的影响。6.通过Transwell小室法侵袭实验,检测转染Twist shRNA质粒组、正常对照组和阴性对照组卵巢癌细胞的侵袭能力,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞增殖能力的影响。7.采用粘附实验检测转染shRNA质粒组、正常对照组和阴性对照组卵巢癌细胞的粘附情况,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞粘附能力的影响。8.采用RT-PCR方法检测转染shRNA质粒转然组、正常对照组和阴性对照组卵巢癌细胞中E-eadherin和N-cadherin的mRNA表达,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞的E-eadherin和N-cadherin mRNA表达的影响。9.Westemblot技术检测转染shRNA质粒转染组、正常对照组和阴性对照组细胞中E-eadherin和N-cadherin的蛋白表达,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞的E-eadherin和N-cadherin蛋白表达的影响。结果1.重组载体pGenesil2-Twist shRNA1和pGenesil2-Twist shRNA2经酶切鉴定和测序,结果显示两对重组载体pGenesil2-Twist shRNA均构建成功。2.转染成功的卵巢癌细胞在显微镜下可以观察到绿色荧光(GFP),转染Twist shRNA质粒24h的卵巢癌A2780细胞的转染效率为70%以上,转染Twist shRNA质粒48h的卵巢癌A2780细胞的转染效率为80%以上。3.RT-PCR测定转染pGenesil2-Twist shRNA质粒48h后Twist mRNA的表达结果显示,Twist扩增产物(455bp)与内参照GAPDH的比值在正常对照组、阴性对照组、shRNA1转染组和shRNA2转染组分别为(1.04±0.028)、(1.10±0.026)、(0.38±0.033)和(0.51±0.029),阴性对照组和正常对照组比较差异无显著性(P>0.05), shRNA1、 shRNA2重组质粒转染组与正常对照组和阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05)。 shRNA1质粒转染对Twist mRNA的干扰效率为65%, shRNA2质粒转染对Twist mRNA的干扰效率为56%。4.Western blot检测正常对照组和阴性对照细胞组的Twist蛋白表达明显高于转染shRNA1、shRNA2质粒细胞组的蛋白表达水平,差异具有显著性(P<0.05),其中转染shRNA1质粒组蛋白表达水平最低,与RT-PCR检测结果一致,之后应用shRNA1质粒进行后续实验。5.MTT法检测卵巢癌细胞的增殖结果显示,在转染后24h、48h和72h,Twist shRNA质粒转染组A2780细胞数与正常对照组和阴性对照组相比没有明显差异(P>0.05)。6.Transwell小室法侵袭实验结果显示,与正常对照组、阴性对照组相比,转染Twist shRNA质粒组侵袭细胞数明减少(P<0.05)。而正常对照组和阴性对照组之间相比,侵袭细胞数无统计学差异(P>0.05)。7.粘附实验结果表明,和正常对照组和阴性对照组比较,转染组细胞的粘附能力明显降低(*P<0.05)。8.RT-PCR和Western-blot方法检测转染Twist shRNA质粒组中E-cadherin的mRAN和蛋白表达较正常对照组和阴性对照组明显升高(P均<0.05),N-cadhein的的表达较正常对照组和阴性对照组明显降低(P<0.05),而正常对照组和阴性对照组中E-cadherin和N-cadhein的表达无明显差异(P均>0.05)。结论1.抑制人卵巢癌A2780细胞中Twist基因的表达,不影响卵巢癌细胞的体外增殖能力,但可降低卵巢癌细胞体外侵袭能力及与基质之间的粘附能力。2.抑制人卵巢癌A2780细胞中Twist基因的表达,可抑制卵巢癌细胞的上皮间充质转化。3.在卵巢癌上皮-间质转化及侵袭转移过程中Twist可能发挥重要作用,意义本研究应用RNAi技术抑制了卵巢癌细胞中Twist基因的表达,从而抑制了卵巢癌细胞的侵袭转移和上皮间质转化,为卵巢癌治疗提供了一个新靶点。