1.背景:肺癌是全世界最普遍的癌症,每年确诊的新病例超过180万。根据组织病理学分类,被分为两种类型:非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),其中NSCLC比重最大,占80-85%,并可被进一步分为三种亚型,即腺癌,鳞状细胞癌和大细胞癌。目前为止,NSCLC的总体预后仍然很差,5年生存率只有15%。近年来,肺癌的高发病率对人类健康构成了严重威胁。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)是一类被定义为非蛋白编码转录本的异构RNA。它们通过调控基因的转录、翻译以及表观遗传修饰在癌症的发生发展中发挥着重要的作用。大量研究表明,lnc RNA具有相当复杂的功能,这些功能在许多癌症类型中主要发挥致癌作用或抑癌作用。MALAT1(肺腺癌转移相关转录物1),也称为非编码核富集丰富转录本2(NEAT2),是一种有研究价值的肿瘤标志物,也是限制转移性生长的潜在治疗靶点。最近的研究中发现,MALAT1参与很多癌症的转移和复发,在胃癌,膀胱癌,乳腺癌和肺癌等多种实体瘤中上调。在先前的研究中发现,MALAT1通过促进细胞增殖来驱动肿瘤发生,MALAT1的耗竭(敲除和敲除策略)可以抑制体外细胞移动性和体内癌症的进展。岩藻糖基转移酶(fucosyltransferases,FUTs)是一类参与岩藻糖寡糖合成的关键酶,可以催化岩藻糖发生异常糖基化。FUT家族包括四个子家族,即α1、2-(FUT1和2),α1、3/4-(FUT 3、4、5、6、7、9、10、11),α1、6-(FUT8)和蛋白质O-FUT(POFUT1和POFUT2)。α1,3岩藻糖基转移酶(FUT4)是一种关键酶,可催化GDP-岩藻糖的糖基Fuc转移至β-N-乙酰氨基葡萄糖的糖链上,并参与调节与肿瘤相关的碳水化合物抗原Lewis Y(Le Y)的合成。研究已发现Le Y会诱导表皮生长因子(EGFR)的激活和糖基化,从而导致体外口腔癌细胞迁移。肿瘤糖生物学研究明确表明,FUT4是一种重要的岩藻糖转移酶,在多种癌症类型中均有高表达,并且在肿瘤增殖、凋亡、转移和上皮间充质传递(EMT)中起着至关重要的作用,但其驱动调节机制仍不明确。MALAT1和FUT4在癌症的增殖和转移中均发挥重要作用,但在肺癌中的作用尚不清楚,有待进一步研究。因此,本研究探讨了MALAT1和FUT4在肺癌进展中的作用,证实MALAT1和FUT4在临床病理分期中的相关性。此外,我们还发现MALAT1通过PI3K/Akt信号通路调控FUT4,促进增殖和转移。本研究将为肺癌的诊断、治疗和疗效评价提供新的生物标志物。2.目的:1.探讨MALAT1和FUT4在人肺癌组织和血清中的表达及相关性。2.探讨和比较MALAT1和FUT4在不同肺癌细胞系中的表达。3.通过调控肺癌细胞系FUT4,检测MALAT1在肺癌细胞增殖和侵袭中的作用。4.研究MALAT1对于α1,3-fucosylation的表达的影响。5.检测MALAT1对于PI3K/Akt信号通路的影响。3.材料与方法:本研究所选样本来自大连医科大学附属第一医院检验科与病理科(大连,中国)2017年3月至2018年7月期间的组织样本和血清样本,包括50例新鲜冰冻的肺癌组织和癌旁组织,以及50例正常和肺癌I-IV期的血清样本。利用实时荧光定量PCR,ELISA,Western blot,免疫组化技术检测MALAT1和FUT4基因的表达,SPSS统计软件分析血清中MALAT1和FUT4之间的Spearman相关性。此外,为了进行体外模型研究,我们从大连医科大学临床实验室液氮罐中复苏了A549,H1299和HBE细胞系。首先,通过实时荧光定量PCR,Western blot和免疫荧光法检测MALAT1和FUT4基因的表达以证明MALAT1和FUT4之间的关系。瞬时转染技术利用lipofectamine2000试剂转染si RNA和c DNA敲减或上调MALAT1和FUT4的表达来研究他们对肿瘤增值和转移的影响。对LTL和Le Y的进行免疫沉淀,以确定α1,3-键岩藻糖基化聚糖与LTL和Le Y之间的联系。另外,细胞活力实验、克隆形成等实验,用来进行细胞增殖、迁移和侵袭测定。4.结果:临床组织样本表明,与癌旁组织相比,肺癌组织中FUT4和MALAT1的m RNA表达显著增加,并且之间呈正相关。此外,我们应用蛋白质印迹法研究了FUT4在肺癌组织和邻近组织中蛋白水平的表达。与邻近组织相比,FUT4的表达在肺癌组织中显着增加。为了进一步研究,我们用q PCR技术检测了健康人、肺癌患者和接受常规化疗的患者血清样品中MALAT1和FUT4的表达。结果表明,与正常人相比,肺癌患者血清中MALAT1和FUT4的表达显着增加,而化疗后,MALAT1和FUT4的表达则显着下降。此外,我们进行了更多研究加以证实,ELISA结果表明,与正常人相比,肺癌患者中FUT4的表达明显增加,而与肺癌患者相比,化疗后FUT4的表达则明显下降。这些证据表明MALAT1和FUT4之间呈正相关关系且在肺癌患者组织和血清中呈高表达。此外,体外模型中,我们应用q PCR技术检测了A549和H1299肺癌细胞和HBE肺正常细胞中MALAT1和FUT4的表达。我们观察到与正常细胞相比,MALAT1和FUT4在癌细胞中的表达明显较高。之后我们进行CCK-8、克隆形成和Transwell小室实验,评估A549和H1299细胞进行si-MALAT1或FUT4 c DNA转染后细胞的增殖与转移能力。我们发现与转染后的细胞相比,MALAT1显著提高了A549和H1299细胞的细胞增殖与转移率,此外免疫荧光染色结果表明,与对照组细胞相比,转染si-MALAT1癌细胞中FUT4的表达降低,进一步证明了二者之间呈正相关。Le Y的生物合成也表现出一致的变化。利用EGFR抗体免疫沉淀后,用LTL和Le Y抗体检测二者分析的水平。我们发现,siMALAT1转染降低了EGFR沉淀下来的Le Y水平,间接证明了MALAT1的低表达可以降低α1,3-岩藻糖基化。这些发现表明,MALAT1在EGFR岩藻糖基化过程中起促进作用。并为进一步探讨MALAT1介导PI3K/AKT的信号传导途径的活化提供思路。为了进一步评估PI3K/Akt信号通路的激活情况,我们分析了MALAT1对PI3K/Akt信号通路的激活作用。5.结论:1.在肺癌患者组织和血清中,Lnc RNA MALAT1和FUT4高表达且二者呈正相关2.在肺癌细胞系中,Lnc RNA MALAT1上调FUT4的表达。3.Lnc RNA MALAT1通过调节FUT4可以促进肺癌细胞增殖和转移。4.Lnc RNA MALAT1调节表皮生长因子受体关键分子α1,3-fucosylation在肺癌中的表达,并且激活PI3K/Akt信号通路。本研究将开发一种新的肺癌诊断、治疗和预后评估的生物标志物。