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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。研究报道,每年中国乳腺癌新发病数量和死亡数量分别占全世界的12.2%和9.6%,并且有逐年增高的趋势。乳腺癌具有高度的异质性、潜在的侵袭性、复杂的生物学行为,基于此特性,导致其诊断和治疗愈发困难,而且其耐药率也在逐年增加。因此,乳腺癌分子标志物的研究,对于及时了解其恶性程度、预测转移和判断预后意义深远。蛋白质的糖基化是指在糖基转移酶的作用下,将糖基转移至蛋白质,和蛋白质上的特殊氨基酸残基形成糖苷键的过程。糖基化对蛋白具有重要的修饰作用,并且能调控蛋白质的功能。根据糖苷键类型,哺乳动物的蛋白质糖基化可以分为三类,即0-糖苷键型,N-糖苷键型,GPI糖基磷脂酰肌醇锚定型。N-糖基化发生在靶蛋白翻译的过程中,糖基化结构为Asn-X-Ser/Thr,Asn(天冬酰胺),Ser(丝氨酸),Thr(苏氨酸),X是除了脯氨酸外的任意氨基酸。肿瘤细胞中已经检测到了发生糖基化改变的蛋白质。近年来,研究发现N-糖基化修饰是肿瘤发生的潜在因素。有报道称,上皮细胞钙粘蛋白经N-糖基化修饰后可以增加胃癌细胞侵袭时的黏附作用。由此可见,N-糖基化的研究,将有助于我们进一步探索肿瘤发生的内在机制。上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecules,Ep CAM)是表达在多种组织上的I型跨膜糖蛋白,人类基因编码的Ep CAM定位于2号染色体(2p21)分子量大约为40KD,是一种由314个氨基酸aa(amino acid)组成的多肽,主要结构是242个aa组成的胞外区(称为Ep EX),23个aa组成的跨膜区,26个aa组成的胞内区(Ep ICD)。研究发现Ep ICD表达的丢失常发生于人类上皮癌中。Ep CAM胞外结构域有三个糖基化位点(N198,N111,N74),N198糖基化位点突变将导致Ep CAM表达量下降。此外,与野生型相比,将三个糖基化位点敲除可以把蛋白质的半衰期从21小时减少到7小时,所以N-糖基化位点对于Ep CAM的生物学活性有至关重要的作用。Ep CAM是多能干细胞的标志物,它的表达随着干/组细胞分化成不同的成熟细胞系而减弱。因此,Ep CAM的变异可能在人类恶性肿瘤中发挥重要作用。Ep CAM水平不仅受到基因表达变化的影响,还受到转录和翻译后修饰水平的影响。因此,糖基化可能在Ep CAM细胞表面表达调控中发挥重要作用。前期研究发现Ep CAM在乳腺癌上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的过程中起到了一定的作用,然而下调Ep CAM的表达可以抑制乳腺癌细胞的生长和转移,它是通过抑制Ras/Raf细胞外信号调节激酶调节通路和基质金属蛋白酶MMP-9来实现的。这些结果表明,Ep CAM不仅可以作为乳腺癌细胞生长的调节分子,而且可以作为其预后的潜在标志物。自噬(autophagy)是指在囊泡中将受损的细胞器、蛋白质或脂质降解和循环的过程。降解发生在自噬体与溶酶体融合后,降解产物在细胞质中进行回收。自噬对清除线粒体和未折叠蛋白等受损细胞器非常重要,在营养缺乏等应激条件下还可维持体内代谢平衡。自噬有三种形式,巨自噬,微自噬,分子伴侣介导的自噬。巨自噬(以下简称自噬)是一种自食的过程,吞噬细胞质蛋白、复合物或细胞器进入自噬体(一种细胞质双层膜结构),自噬体要么被整合到晚期核内体中,要么被运输到溶酶体中,与溶酶体融合生成自溶酶体,然后在酸性水解酶的作用下释放和降解。产生的降解产物包括核苷酸、氨基酸、脂肪酸和糖,再循环进行一般的细胞代谢。前期研究发现,去糖基化的Ep CAM的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞,可以通过ERK/MAPK信号通路调节凋亡相关的蛋白,增加5-氟尿嘧啶(5-FU)细胞毒性效应。有研究表明,ERK通路除了在凋亡中扮演了重要的角色,也可以通过调节Akt和m TOR来调节不同模式的细胞死亡。早期报道指出,涉及到ERK1/2的通路可以引起自噬性细胞死亡。而且,PI3K/Akt/m TOR是公认的自噬调节通路。基于上述文献,我们推测,Ep CAM N-糖基化修饰可以通过PI3K/Akt/m TOR信号通路调节乳腺癌细胞的自噬,并影响其增殖与凋亡。实验方法:1.Western-Blot检测自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3蛋白的表达水平。2.p GFP-LC3绿色荧光融合蛋白实验和透射电镜检测Ep CAM N-糖基化修饰的乳腺癌细胞中自噬小体数量。3.Western-Blot检测EpCAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞加入自噬调节剂后凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax及增殖蛋白PCNA的表达。4.CCK8实验检测EpCAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞加入自噬调节剂后细胞的增殖情况。5.Western-Blot检测通路PI3K/Akt/m TOR中相关蛋白及自噬相关蛋白的表达。6.pGFP-LC3绿色荧光融合蛋白实验和透射电镜检测EpCAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞加入Akt的抑制剂MK-2206后,自噬小体的数量。实验结果:1.Ep CAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加,P62表达降低。2.p GFP-LC3绿色荧光融合蛋白实验及透射电镜结果均显示:Ep CAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞自噬小体明显升高。3.加入自噬激活剂的EpCAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞,凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Bax表达升高,Bcl2表达降低;增殖相关蛋白PCNA表达降低。4.CCK8实验显示:乳腺癌细胞加入自噬抑制剂,细胞增殖能力增加;加入自噬激活剂,细胞增殖能力减弱;而Ep CAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞及其加入自噬调节剂后,细胞的增殖能力均明显减弱。5.加入Akt的抑制剂MK-2206后,EpCAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞中,PI3K/Akt/m TOR通路的蛋白p-Akt、p-m TOR表达均明显减少,而自噬蛋白表达增高。6.p GFP-LC3绿色荧光融合蛋白实验及透射电镜结果均显示:加入Akt的抑制剂MK-2206后,Ep CAM N-糖基化突变的乳腺癌细胞自噬小体的数量明显升高。实验结论:1.乳腺癌细胞Ep CAM N-糖基化的敲除能增强其自噬能力。2.Ep CAM N-糖基化敲除的乳腺癌细胞可以通过上调自噬来抑制其增殖能力,增强其凋亡能力。3.Ep CAM N-糖基化敲除可以通过抑制PI3K/Akt/m TOR通路来增强乳腺癌细胞的自噬