快速碱化因子(rapid alkalinization factor RALF)属于多肽激素中的一类。目前已经发现的有:系统素(systemin)、植物磺化激动素(phytosulfokine PSK)、早期结瘤蛋白40(earlr nodulation ENOD40)、S位富含半胱氨酸蛋白(S-locuscysteine-rich protein SCR)、CLAVATA3及快速碱化因子(rapid alkalinization factorRALF)。系统素是在研究系统伤响应时鉴定的第一个多肽信号分子,之后陆续发现其他的几种。快速碱化因子是2001年对烟草的系统素进行提取纯化时偶然发现的,由于该蛋白能引起烟草悬浮细胞的培养基快速碱化,因此命名为快速碱化因子。有研究表明RALF有引起悬浮细胞培养基碱化、激活细胞内MAPK(mitorgcn-activated protein kinase)、参与植物生长发育调控等生理作用研究表明外施RALF蛋白能够抑制萌发种子的根的伸长区和分裂组织、根毛缺失、分生细胞增大。有研究表明RALF能够调控植物生长发育的方向及节奏,然而RALF是否参与植物的胁迫反应尚未出现相关报道。　　 蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus)落叶丛生灌木,冬季开花并且耐寒、耐旱、耐剪。RALF是否参与其高效的逆境防御机制以及生长发育过程值得深入探讨。本实验从已构建好的蜡梅花cDNA文库中克隆到一个RALF序列,命名为CpRALF,Genebank登录号为:JQ217379。对其序列分析;构建原核表达载体并使其在大肠杆菌中表达,并且对获得的融合蛋白进行功能验证;构建植物超表达载体;对CpRALF在蜡梅不同组织以及胁迫反应中的转录表达水平进行研究,主要的研究结果有:　　 1、CpRALF的分子特征　　 通过随机挑选蜡梅花cDNA文库测序,获得了大小约为400bp的EST序列,然后通过RACE技术获得cDNA全长。BLASTX比对显示,其与快速碱化因子蛋白具有较高的同源性,初步推断所获得的cDNA编码快速碱化因子蛋白。获得的cDNA序列中含有384bp的开放阅读框,编码蛋白长127个氨基酸。序列结构分析显示,CpRALF编码蛋白的C端含有快速碱化因子特有的YIXY、YXRGC基序以及四个半胱氨酸、双精氨酸结构。　　 2、CpRALF基因的原核表达及融合蛋白的活性检测　　 构建了CpRALF的原核表达载体pET32-CpRALF,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导,得到了与预期一致的分子量为27KDa的融合蛋白。获得的融合蛋白可以使烟草悬浮培养的培养基轻微碱化,并且能抑制拟南芥根的生长。　　 3、CpRALF基因的转录水平分析　　 对CpRALF进行实时荧光定量PCR分析表明:CpRALF基因在蜡梅不同组织中表达有差异,根和盛开花中的表达量最高;在3轮花器官中的表达分析表明,在外瓣和雄蕊中的表达量最低,中瓣最高,内瓣、雌蕊低于中瓣并依次降低。不同花发育时期表达分析表明,蕾期和衰败期的表达量最高,萌动期基本不表达,露瓣、初开、盛开的表达水平低于蕾期和衰败期并呈现上升趋势。对蜡梅幼苗进行胁迫处理后分析CpRALF基因的表达情况,结果表明,高盐(NaCl)、重金属(CuSO4)、高温(42℃)胁迫会引起CpRALF表达量的升高,而低温(4℃)胁迫则会抑制CpRALF的表达。并且CpRALF对高盐和重金属胁迫的响应比高温和低温胁迫的响应更为迅速和剧烈。表明CpRALF可能在植物的发育及胁迫中起到一定作用。　　 4、CpRALF基因在烟草中的超表达　　 构建植物表达载体pCAMBIA2301g-CpRALF,并转化农杆菌LBA4404。应用农杆菌介导的叶盘法将含有CpRALF基因的植物表达载体转入野生烟草植株中,通过抗性筛选、GUS组织化学染色、PCR扩增以及实时荧光定量检测,获得转基因烟草植株。