杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）是大黄鱼（Larimichthys crocea）内脏白点病（Visceral granulomas disease,VGD）的病原菌,该菌能感染包括大黄鱼、小黄鱼（Larimichthys polyactis）、条石鲷（Oplegnathus fasciatus）、黄姑鱼（Nibea albiflora）以及石斑鱼（Epinephelinae）等在内的多种水产养殖经济鱼类。杀香鱼假单胞菌导致的内脏白点病造成的经济损失约占大黄鱼养殖总产值的10%左右,严重阻碍了大黄鱼产业的健康可持续发展,因此,有必要研发一种操作简便、判读简单、适合于大黄鱼内脏白点病现场快速诊断的检测方法。本研究以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白（hemolysin co-regulated protein,Hcp）为抗原,从兔天然噬菌体单链抗体（single chain antibody fragment,sc Fv）文库中筛选出抗杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白（Hcp-sc Fv）,构建重组质粒p ET-30a-hcp-sc Fv并进行诱导表达,获得抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的特异性sc Fv,以期为大黄鱼内脏白点病临床快速诊断技术的研发奠定基础。具体研究结果如下:1、抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的筛选:采用固相化抗原筛选方法,以杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白（p ET-30a-Hcp）为抗原,从兔天然噬菌体单链抗体（sc Fv）文库中筛选目的抗体,结果:筛选出16个针对杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的单链抗体（hcp-sc Fv）;通过亲和力和基因序列分析,最终获得7个特异性较高的hcp-sc Fv,分别命名为A5、F11、G5、G8、D2、D10、H12。2、抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的制备:根据7个hcp-sc Fv的基因序列设计特异性引物,采用PCR方法对单链抗体目的基因进行扩增,并插入到p ET-30a（+）载体,构建原核表达质粒（p ET-30a-hcp-sc Fv）。PCR鉴定和双酶切分析结果显示7个重组质粒均构建正确。将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）p Lys S进行诱导表达。结果:A5、F11、G5、G8、D2、D10这6个重组菌在IPTG终浓度为0.4mmol/m L,30℃诱导5 h的条件下可稳定表达;重组蛋白的可溶性分析结果显示,F11、G8、D2、D10重组蛋白以包涵体的形式存在,A5、G5重组蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种存在形式;纯化获得的重组蛋白对抗His-Tag鼠单抗有免疫反应,蛋白分子量大小在35 k Da左右,与预期相符。3、基于sc Fv的杀香鱼假单胞菌ELISA法的建立:选择A5和F11两个表达稳定的重组蛋白,进行了杀香鱼假单胞菌间接ELISA法的建立,结果:F11对杀香鱼假单胞菌的亲和力较差,A5对杀香鱼假单胞菌的亲和力较高;利用棋盘法确定杀香鱼假单胞菌包被浓度为5×10~6 cfu/m L,A5工作浓度为100μg/m L,抗原包被条件为4℃过夜,酶标二抗稀释度为1:2000,酶标二抗孵育条件为37℃孵育1h,显色条件为37℃显色10 min,阴阳性判定的临界值为0.456;利用建立的间接ELISA法进行灵敏度和特异性实验,结果显示该方法灵敏度为5×10~4cfu/m L,特异性实验结果显示A5与诺卡氏菌（Nocardia）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella retardans）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）无交叉反应,但与哈维氏弧菌（Vibrio harzianus）出现交叉反应。综上,本研究制备了6个抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体,同时针对其中两个单链抗体A5、F11建立了杀香鱼假单胞菌的间接ELISA检测方法。实验结果表明制备的单链抗体有望用于大黄鱼内脏白点病病原菌的检测,为大黄鱼内脏白点病临床快速诊断技术的研发提供了理论依据和基础。