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目的穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty, PKP)的术后免疫排斥反应是导致手术失败的最主要原因。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有调节多种免疫细胞(包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及树突状细胞)增殖和功能的作用。在前期研究中我们发现MSCs可以延长角膜植片存活时间,在此基础上,本研究通过大鼠异体角膜移植排斥反应动物模型,观察不同时期尾静脉注射MSCs,以及MSCs联合不同浓度环孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)对角膜抑制排斥反应发生和转归的干预情况,初步阐明MSCs的免疫调节机理,以及MSCs与CsA之间的联合作用,为临床治疗角膜移植排斥反应提供新的思路和可供选择的方法。方法1.原代培养Wistar大鼠MSCs,达90%融合时传代培养。用流式细胞仪检测培养细胞的表型,并做体外诱导分化实验,以备后续实验使用。2.制作大鼠角膜移植动物模型,随机分为12组。注：其中(A、B、C组为重复上一阶段实验组)A组：对照组,给予等量不含药物的PBS。B组：术前尾静脉注射MSCs组。C组：术后尾静脉注射MSCs组。D组：排斥发生时尾静脉注射MSCs组。E组：术后注射MSCs+肌注1mg/kg/天CsA。F组：术后注射等量PBS+肌注1mg/kg/天CsA。G组：术后注射MSCs+肌注2mg/kg/天CsA。H组：术后注射等量PBS+肌注2mg/kg/天CsA。1组：术后注射MSCs+肌注5mg/kg/天CsA。J组：术后注射等量PBS+肌注5mg/kg/天CsA。K组：术后注射MSCs+肌注10mg/kg/天CsA。L组：术后注射等量PBS+肌注10mg/kg/天CsA。裂隙灯下对角膜植片进行临床观察,以混浊、水肿和新生血管3项指标作为临床评估标准,比较各组角膜植片的平均存活时间。3.角膜移植模型建立后10天,收集A、C、G与H组大鼠脾脏以及腹股沟淋巴结,分离单个核细胞,在刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)刺激下孵育72h后,采用BrdU试剂盒检测各组大鼠免疫应答强度。4.取ConA剌激下A、C、G与H组大鼠脾脏和淋巴结单个核细胞孵育72h后的上清液,采用ELISA试剂盒检测Thl类和Th2类细胞因子分泌情况。5.角膜移植模型建立后10天,取A组和C组大鼠脾脏以及淋巴结,流式细胞仪测定CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的百分比。结果1.成功分离并鉴定了MSCs, MSCs呈间质细胞特性：梭形,漩涡状排列。VonKossa染色、油红染色贴壁细胞呈骨样细胞及脂肪样细胞分化。2.成功建立大鼠角膜移植动物模型。3.采用MSCs单独治疗角膜移植术后大鼠,术后注射组角膜植片的存活时间与A组相比明显延长(P<0.05)。术前和排斥时治疗组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.单独使用CsA治疗角膜移植术后大鼠,除F组,H、J和L组大鼠角膜植片存活时间均显著延长(P<0.05)。5.MSCs与2mg/kg的CsA联合治疗大鼠排斥模型时(G组),与单独使用MSCs或2mg/kgCsA相比(C和H组),植片存活时间延长。MSCs与5mg/kgCsA或10mg/kgCsA联合应用时,联合效果不显著(P>0.05)。而MSCs lmg/kgCsA联合应用时,MSCs对植片的保护作用被逆转(P<0.05)。6.T细胞增殖实验表明,MSCs和/或CsA均可以显著抑制T细胞增殖(P<0.05)。7. ELISA结果显示,C、G、H组Th1细胞因子分泌显著降低(P<0.05),而Th2细胞因子(IL-4)分泌升高(P<0.05)。与对照组(A组)相比,C组大鼠体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例显著增高(P<0.05)。结论MSCs可以通过抑制T细胞免疫应答、改变Th1/Th2应答平衡以及上调调节性T细胞,有效预防并治疗角膜移植免疫排斥反应。MSCs与CsA联合使用,其效果取决于CsA的浓度。