一研究背景近年来,恶性肿瘤的发病率呈持续升高,因化疗而导致卵巢功能低下和不孕的患者日渐增多,成为POF发病的一个重要原因。化疗治疗用药易引发生肝、肾毒性,形成肝肾阴虚证,虚火内扰,冲任失充,气血化源不足,性腺失养而功能低下,甚至造成闭经和不孕。本病确切病因尚不清楚,在临床防治中多采用激素替代治疗(hormone replacement therapy,HRT)方法。但大量报道表明,目前的HRT可增加了雌激素依赖性肿瘤的发病风险。寻找安全、高效物植物药物是目前POF防治研究中的难点之一。二研究目的以建立稳定的化疗损伤性POF动物模型为平台,探讨GEN对化疗损伤性POF的治疗作用及机制,揭示中药单体的分子药理作用靶标,挖掘POF发病及GEN治疗作用的基因表达特征,绘制其网络调控的生物信息学图谱,从而完善中药雌激素受体调节剂HRT治疗作用学说。三研究方法应用顺铂(cis-diamminedichloroplatinum, CDDP)注射ICR小鼠腹腔给药方法,构建化疗损伤性POF动物模型,为系统化研究POF搭建动物实验平台;采集大鼠卵巢颗粒细胞进行体外原代培养,为深入研究POF建立起细胞研究平台;运用免疫组织化学技术、电子显微镜技术、蛋白免疫印迹技术、酶联免疫技术、流式细胞分析技术、激光共聚焦技术、基因芯片技术和生物信息分析技术等方法,系统研究POF的病理机制及GEN的影响作用途径与作用靶点。四研究结果1.化疗损伤性POF动物模型建立与评价应用3.0mg/kg剂量的CDDP,对ICR小鼠连续腹腔注射给药7d,即可较好地模拟出化疗损伤性卵巢功能早衰的发病过程:其生物学行为性状改变符合POF的临床表现,证属肝肾阴虚;血清卵巢激素水平下降,促性腺素水平升高;卵巢组织学出现生长卵泡发育阻滞,卵泡闭锁增加,间质部分增生、纤维化样改变。通过病理机制分析,发现CDDP是通过两条途径影响卵巢功能:①对DNA直接损伤;②氧化损伤作用。此模型成功率高,成模时间短,动物模型评价效果好。2.GEN对化疗损伤性POF的治疗作用及机制GEN可明显改善模型动物生物学状态,体重增加,周期排卵和动情周期恢复近正常;血清雌二醇和孕酮水平恢复近正常,且随GEN剂量增加,而孕酮表现更为明显;雌、孕激素受体免疫组化结果表明,GEN可明显上调节ER和PR表达,以PR增强为著;GEN可降低卵巢组织中丙二醛(MDA)含量,提高其总抗氧化能力(T-AOC);GEN可相对降低MMP-2、MMP-9、TGFβ和LN的表达,从而有利于卵巢组织结构的重建,促进卵泡成熟与排出;GEN用药后卵巢颗粒细胞器丰富,高尔基复合体、滑面内质网较多,卵泡膜内层细胞(间质腺细胞)高尔基复合体、粗面内质网及线粒体较多,核糖体丰富。GEN可能主要是通过三条作用途径发挥其改善卵巢功能的作用:①较强的抗氧化损伤作用,修复损伤的DNA,从而激活卵巢颗粒内源性蛋白激酶活性,重新构建起激素合成与分泌的分子基础;②增加卵巢细胞ER和PR的表达,提高受体敏感性,并以PR表达增加为主要,从而对卵巢功能起到自我校正作用;③调节细胞外基质的形成与降解的平衡,从而改善卵泡和颗粒细胞功能状态,促进其分化与成熟。3.GEN对CDDP作用后卵巢颗粒细胞功能调节机制CDDP可明显抑制卵巢颗粒细胞增殖,其对细胞周期较为明显的作用位点是S期,并可使细胞周期阻滞于G1-M期,凋亡细胞明显增加。GEN可对抗CDDP的损伤效应,提高细胞的分化与增殖能力,明显消除细胞周期阻滞现象,其最佳作用时间点为24h,此作用与GEN呈剂量关系;GEN可提高卵巢颗粒细胞内Ca2+浓度,抑制CDDP造成的凋亡作用。4.POF发病及GEN影响的差异基因表达谱基因芯片信息分析表明,CDDP可上调137条基因表达,下调110条基因表达,对卵巢细胞功能表达起到明显的抑制作用,这些基因主要作用于DNA合成、跨膜能量代谢和细胞核因子激活等方面,从而造成部分基因网络调控失衡而致病;GEN可上调22条基因表达,下调38条基因表达,这些基因主要与激素合成、DNA损伤修复和能量代谢密切相关,对于部分细胞信号转导中关键通路的建立与网络化调控起到了重要作用。五研究结论通过综合运用形态学、分子生物学和生物信息学技术与理论,所建立的动物模型较为全面地表现了POF病理过程。CDDP主要是通过氧化损伤和影响DNA合成完成的。GEN是较为理想的POF治疗药物,主要是通过改善卵巢细胞周期,抑制卵巢颗粒细胞凋亡,激活ER和PR活力,改善卵巢间质功能状态,为卵巢重构和排卵奠定基础。