研究背景和目的丙型病毒性肝炎是一种严重威胁人类健康的传染性疾病,在世界范围内广泛流行,目前全球大约有1.85亿人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)。HCV感染后有74-86%的人发展为以肝纤维化为主要特征的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C virus,CHC),并有潜在发展为肝硬化和肝细胞癌倾向。中国人群HCV感染率为3.2%,HCV感染在中国已经成为乙型病毒性肝炎、结核、痢疾之后第四大传染性疾病,尤其是35岁以上人群的HCV感染率持续增长,严重威胁着个人健康,给家庭和社会造成了沉重的经济负担。目前抗病毒治疗是慢性丙型肝炎唯一有效的治疗手段。自2011年直接作用抗病毒(direct acting antivirals,DAAs)药物问世以来,丙型肝炎的治疗取得了突破性进展。研究显示,在西方发达国家,HCV NS5B核苷酸类似物sofosbuvir联合利巴韦林或其他抗病毒药物能够治愈90%的HCV感染者。然而,由于价格昂贵,sofosbuvir等核苷酸类似物抗HCV药物在我国至今仍未上市,基于干扰素联合利巴韦林的抗病毒治疗方案目前仍是中国和一些发展中国家公认的治疗慢性丙型肝炎的首选药物。然而,按照传统的聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗,仍会有将近50%的CHC患者不能获得持久病毒学应答(sustained virological response,SVR)。因此,筛选影响抗病毒治疗疗效的可能因素,完善抗病毒治疗方案就显得尤为重要。髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是由骨髓祖细胞和非成熟的髓样细胞组成的异质细胞群体,包括不成熟粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells,DCs)等。其共同的特征是:骨髓起源、未成熟状态和显著的T细胞抑制功能。MDSCs在人体内主要出现在外周血中。最近研究显示髓源抑制细胞可以在肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病中大量积聚,并与疾病的不良预后有密切关系。当发生微生物、寄生虫或病毒感染、化疗、自身免疫性疾病、应激以后,均会促进MDSCs增多。一项研究显示HCV慢性感染可以诱导MDSCs的增长,该群细胞能够有效抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖和IFN-γ的产生,导致HCV感染的慢性化。最近的报道显示抗HCV病毒治疗后,HCV慢性感染者血液中的HCV病毒载量与MDSCs具有相同的下降趋势,证明HCV病毒能够促进MDSCs的产生。大量研究已证实MDSCs数量的增长与肿瘤的不良预后密切相关,但MDSCs与丙型肝炎患者抗病毒治疗临床预后的关系尚不十分清楚。本次研究重点了解髓源抑制细胞对CHC患者干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗临床预后的影响及其潜在的机制。研究材料与方法 1研究材料2011年6月至2013年6月间,郑州大学第一附属医院感染科和消化内科收治的初治慢性丙型肝炎感染者共计206例(血清检测HCV RNA和HCV抗体均阳性,既往未接受过干扰素联合利巴韦林治疗),均接受标准疗程聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗(PEG-IFN/RBV),停药随访24周。所有患者排除以下情况:妊娠或哺乳期妇女,酒精性肝病、药物性肝病、以及失代偿期肝硬化者,合并其他肝炎病毒及艾滋病感染者,6个月内接受过免疫抑制剂治疗者,自身免疫性疾病患者,严重精神性疾病特别是抑郁症患者,恶性肿瘤、甲状腺疾病及吸毒或酗酒者,严重心脑血管疾病患者。共有180例病例最终完成整个治疗和随访计划、资料齐全,被纳入统计分析。其中127例获得持久病毒学应答(SVR),53例未获得持久病毒学应答(Non-SVR)。20例健康人组成健康对照组。2研究方法本次研究采用巢式病例对照研究方法,从病例就诊住院跟踪随访到治疗停药满24周,观察SVR获得情况。未获得SVR的病例为病例组,获得SVR的病例为对照组。随访观察和收集了所有病例的人口学特征、临床病理参数以及接受PEG-IFN/RBV治疗疗效的相关数据;采集初治慢性丙型肝炎患者PEG-IFN/RBV抗病毒治疗前后外周静脉血10ml,密度梯度离心法获得单个核细胞,流式细胞仪(FACS)检测HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+cell(M-MDSC)和HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+cell(G-MDSC)细胞含量及STAT3表达水平、CD4+T和CD8+T细胞增殖、功能、细胞周期和表型;采用流式细胞仪分选纯化M-MDSC和G-MDSC,q RT-PCR检测两群细胞免疫抑制性基因表达;MDSC与磁珠分选的CD4+T和CD8+T细胞共孵育,研究其对T细胞免疫抑制功能及表型变化的影响。使用EPIDATA3.0建立数据库录入数据。应用SPSS统计软件(version 16.0;SPSS Inc,Chicago,IL,USA)和Graph Pad Prism software(version 5.0;San Diego,CA,USA)处理分析数据。定量资料符合正态分布时采用x±s表示,采用One-Way ANOVA test比较两组间变量差异,多组间变量比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)检验;不符合正态分布时采用中位数和区间表示,使用非参数Mann-Whitney U检验分析两组间变量差异,Kruskal-Wallis H检验分析多组间变量差异,两两组间比较采用Nemenyi method检验。定性资料使用绝对数或百分比表示,根据需要采用Chi-square检验或Fisher’s exact probability检验变量的组间差异。采用Pearson相关或Spearman相关分析变量间线性相关关系,采用单因素二分类Logistic回归筛选影响HCV感染者干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗预后的影响因素,将有统计学意义的变量放入多因素二分类Logistic回归分析,确定影响CHC患者抗病毒治疗预后的独立危险因素。采用Receiver operating characteristic curve(ROC)分析确定MDSCs预测SVR的最佳诊断界值(cut-off值)。采用双侧检验,检验水准α=0.05。研究结果 第一部分影响慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗预后因素研究1 206例初治CHC患者纳入研究队列,其中180例完成标准抗病毒治疗和随访,SVR应答率为70.6%;2根据MDSCs表型,将其分为G-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+)和M-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+),Non-SVR组G-MDSCs显著高于SVR组和健康对照(P<0.05),三组M-MDSCs差异无统计学意义(P>0.05);3 G-MDSCs与HCV RNA载量(r=0.41,P<0.01)、ALT(r=0.51,P<0.01)、AST(r=0.46,P<0.01)、LSM(r=0.58,P<0.01)呈正相关关系,与CD4+T细胞(r=-0.24,P<0.01)和CD8+T细胞(r=-0.26,P<0.01)呈负相关关系;M-MDSCs与HCV RNA载量、ALT、AST、CD4+T细胞和CD8+T细胞均无相关关系(P>0.05)。4 ROC分析显示G-MDSCs对SVR的预测价值最大,其最佳诊断界值为5.38%;5单因素和多因素Logistic回归分析显示HCV基因型(CI.95%:3.75-12.33;P<0.01)、外周血G-MDSCs水平(CI.95%:1.62-5.47;P=0.01)和RVR(CI.95%:1.34-8.48;P=0.03)是CHC患者抗病毒治疗获得SVR的独立预测因素。第二部分慢性丙型肝炎患者MDSCs对T细胞功能及表型的影响1 HCV核心蛋白可诱导PBMCs细胞表型向G-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14-)转化而不是M-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14+),PEG-IFN/RBV通过降低HCV RNA减少G-MDSCs含量;2 G-MDSCs能通过细胞-细胞接触方式显著抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖、IFN-γ分泌,Non-SVR患者G-MDSC抑制T细胞增殖的能力明显强于SVR患者(P<0.05),而两组人群M-MDSC对T细胞增殖抑制能力差异无统计学意义(P>0.05);3 G-MDSC可以促进T细胞凋亡(P<0.05),而M-MDSC则不会(P>0.05),Non-SVR患者G-MDSC促进T细胞凋亡的能力显著高于SVR患者(P<0.05);4 G-MDSC能够显著降低S期和G2期CD4+T细胞和CD8+T细胞而增加G0-G1期T细胞比例(P<0.05);5 G-MDSC与中心记忆性CD4+T细胞(r=-0.46,P<0.01)和中心记忆性CD8+T细胞(r=-0.28,P=0.02)呈负相关关;M-MDSC与各记忆性T细胞亚群均无统计学相关性(P>0.05);6 CHC患者G-MDSCs与Treg细胞呈正相关关系(r=0.42,P<0.05),并可诱导Treg细胞生成(P<0.05);M-MDSCs与Treg细胞无线性相关关系(r=0.23,P=0.08),不能诱导Treg细胞增长(P>0.05);7 CHC患者MDSCs诱导T细胞表型的改变,上调T细胞表达PD-1(P<0.05)、CTLA-4和Tim-3(P<0.05),下调OX40表达(P<0.05)。第三部分慢性丙型肝炎患者MDSCs抑制T细胞机制研究1 Non-SVR患者血清中Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β、IL-6、IL-10表达高于健康人和SVR患者,差异有统计学意义(P<0.05);2 Non-SVR患者G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β、IL-6和IL-10基因表达高于健康人和SVR患者,差异有统计学意义(P<0.05);3 Non-SVR患者G-MDSCs中STAT3及p-STAT3表达高于健康人和SVR患者,差异有统计学意义(P<0.05),而M-MDSC中STAT3及p-STAT3表达在三组人群中差异无统计学意义(P>0.05);4 CHC患者使用S31-201阻断MDSC的STAT3,STAT3、p-STAT3以及Arg-1水平均有显著下降(P<0.05);5相对于未阻断STAT3的G-MDSC,阻断STAT3后,G-MDSC对CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖和IFN-γ分泌抑制功能显著下降(P<0.05);6 IL-10刺激能显著增加G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表达(P<0.05);S31-201阻断STAT3可以抑制IL-10活化STAT3引起的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表达增加(P>0.05);7 IL-10能够促进G-MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P<0.05),不能促进M-MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P>0.05);S31-201能够降低MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P<0.05);8 IL-10能够促进G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6 m RNA基因表达(P<0.05),S31-201能够阻断IL-10的这一作用。结论 1 G-MDSCs与HCV RNA载量、ALT、AST、LSM呈正相关关系,与CD4+T细胞和CD8+T细胞呈负相关关系,是CHC患者抗病毒治疗获得SVR的独立预测因素;2 HCV核心蛋白可促进G-MDSCs而不是M-MDSCs增加,PEG-IFN/RBV通过抑制HCV复制显著降低G-MDSCs;3 G-MDSCs能显著抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖、IFN-γ分泌,促进T细胞凋亡,诱导中心记忆性CD4+T细胞和CD8+T细胞分化、Treg细胞扩增,上调T细胞表面PD-1、CTLA-4和Tim-3表达;4 IL-10能够通过激活MDSC的STAT3通路,增加Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表达,增强G-MDSCs对CD4+T细胞和CD8+T细胞的免疫抑制功能。