流感病毒是威胁人类健康和公共卫生的一大重要问题,其中乙型流感(FluB)就是一种引发流感流行的主要病原体。由于流感病毒的持续快速变异,针对其的治疗药物必须具备广谱性。FluB的广谱中和单克隆抗体,尤其IgG型抗体是防治乙型流感病毒的一种潜在的有效手段。本实验室在前期获得一株具有FluB广谱中和活性的IgM型鼠源单克隆抗体7G1。与传统IgG治疗性抗体药物相比,IgM抗体存在成产及纯化工艺较为复杂、抗体介导的杀伤作用较弱、半衰期较短等缺点。本研究开展了一种不依赖于抗体可变区基因克隆的IgG类别转换方法。我们通过在杂交瘤细胞中构建可调控表达活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)的系统,实现在杂交瘤细胞水平进行高频的抗体类别转换,之后利用流式细胞仪分选出IgG型单抗细胞并进行后续抗体体内体外性质鉴定,由此获得功能性IgG单克隆抗体杂交瘤细胞系。具体可以分为三部分。其中第一部分为可诱导表达AID的7G1杂交瘤细胞系的构建。首先,本研究将人AID基因及EGFP基因利用2A肽融合构建到慢病毒表达载体pLenti-TRE3G中,之后利用慢病毒感染并成功筛选获得一个可诱导表达AID的杂交瘤细胞株7G1-Tet-on-AID。接着,本研究利用四环素类似物强力霉素(doxycycline,DOX)诱导该细胞株表达AID,细胞内高浓度的AID再促使细胞进行抗体类别转换。本文第二部分进行类别转换效果的检测及IgG型7G1杂交瘤细胞的分选。通过ELISA抗体分型检测,我们发现7G1-Tet-on-AID细胞上清中分泌有IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3等多种免疫球蛋白,并通过流式分选获得380株具有广谱性的阳性单克隆细胞。本文的第三部分内容为:7G1原始IgM亚型抗体及型别转换所获得的7G1各IgG亚型抗体的体内外的活性的鉴定及比较。首先,本研究初步鉴定并对比了7G1-IgM和7G1-IgG各亚型抗体体外结合活性。我们分别随机挑选每个IgG亚型中的相应的3-4株细胞表达上清进行体外性质的分析,包括血凝抑制试验活性(HI)及微孔中和活性(MN)分析,发现同IgM亚型的原始抗体相比,部分型转后的IgG亚型的相应细胞株上清反应谱变宽:另外,部分经小鼠腹水纯化的7G1-IgG亚型的代表性单抗,也显示出比7G1-IgM更为广谱的病毒反应性。而且,在体外ELISA结合活性实验中,7G1各亚型抗体的病毒结合活性均大大优于7G1-IgM抗体。此外,我们还发现IgG2a和IgG2b亚型的7G1抗体具备抗体Fc介导的清除病毒的ADCC活性,而IgM亚型抗体则无此清除病毒的活性。初步评价了抗体在BALB/c小鼠模型体内的保护效果。我们发现,在高剂量给药的条件下,各7G1亚型单抗均能完全保护小鼠抵抗致死剂量的流感病毒的攻毒。因此,为区分各7G1亚型抗体体内治疗活性的区别,我们降低了抗体的给药剂量。发现在低剂量给药的条件下,IgG2a亚型的抗体治疗效果最佳,IgG1亚型的抗体次之,另外,低剂量的IgG2b和IgG3亚型抗体的体内治疗活性也优于IgM亚型抗体。同时,我们还评价了不同亚型抗体在不同给药途径的条件下体内保护效果的差别,我们发现,IgM亚型抗体仅能通过腹腔给药才能发挥保护作用,而通过尾静脉给药则不能发挥保护作用,而各亚型的IgG抗体无论是腹腔给药还是静脉给药,均能起到良好的体内保护作用。因此,在给药途径的选择上,IgG抗体也显示出了优势。总之,本研究通过对7G1杂交瘤细胞进行含AID的四环素诱导表达系统构建,利用Tet-on调控系统诱导其表达AID,增加杂交瘤细胞Ig基因类别转换的频率,实现了在细胞水平的抗体类别转换。可被借鉴和运用于流感病毒的相关抗体药物和其他抗原的新抗体的研发。