【摘 要】
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植物中MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约为20-24nt非编码小RNA。能够对靶基因mRNA特异的剪切或抑制共翻译过程,从而对基因进行转录后水平的表达调控。在植物生长发育中miRNA起着重要的调控作用。番茄是一种世界性的蔬菜,也是研究浆果果实发育与成熟的模式植物。Slymi R159作为一种高度保守、重要的基因表达调控因子,对番茄叶、花、花药、种子的发育以及育性等重要性状有调控作用,但
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植物中MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约为20-24nt非编码小RNA。能够对靶基因mRNA特异的剪切或抑制共翻译过程,从而对基因进行转录后水平的表达调控。在植物生长发育中miRNA起着重要的调控作用。番茄是一种世界性的蔬菜,也是研究浆果果实发育与成熟的模式植物。Slymi R159作为一种高度保守、重要的基因表达调控因子,对番茄叶、花、花药、种子的发育以及育性等重要性状有调控作用,但是Sly-mi R159a在番茄果实发育中的功能,特别是关于番茄果形发育中的功能还未有相关报道。本研究以番茄为研究材料,通过反向遗传学方法研究Sly-mi R159a在番茄果形形成中的功能,同时利用组织形态学、细胞形态学及分子生物学等方法深入解析Sly-mi R159a在番茄果形形成中分子机理,阐明Sly-mi R159a在转录后介导靶基因调控GA合成和信号转导途径来影响番茄果实形状的作用机制。本文主要结果如下:1、荧光定量PCR实验结果显示,Sly-mi R159a存在时空特异表达模式。成熟的Sly-mi R159a在根中表达丰度较低,在茎、花器官和果实中表达较高。在果实中主要在绿熟时期特异表达。2、分别构建Artifical miRNA过表达载体（35S:ami R159a）、STTM沉默小RNA表达载体（STTM159a）和CRISPR/Cas9敲除载体（CR-mi R159a）,转化农杆菌并通过农杆菌介导法侵染番茄子叶进行遗传转化,并获得相应的转基因材料。3、对转基因植株表型鉴定发现,35S:ami R159a转基因植株早期花发育异常,变黄脱落,果实育性降低,无种子产生。而STTM159a和CR-mi R159a转基因植株花发育正常,育性正常,与野生型相比果实果形指数变小,果实变扁。4、利用石蜡切片方法观察STTM159a转基因植株果实细胞,结果显示与野生型相比,果实中果皮细胞层数没有显著变化,但果皮细胞变小并且细胞指数降低,细胞变扁,说明Sly-mi R159a可以同时影响番茄果实细胞大小和形状。5、利用5’RACE技术鉴定Sly-mi R159a在果实中的靶基因,鉴定Sly-mi R159a的靶基因为Sl GAMYB1和Sl GAMYB2,同时Sl GAMYB1/2在STTM159a植株果实中的表达量显著升高,说明Sl GAMYB1/2可能是Sly-mi R159a在果实果形发育中的靶基因。6、对STTM159a转基因植株进行外源GA和PAC处理,发现GA处理后果实果形有部分恢复,而PAC处理则果形指数更小。表明Sly-mi R159a可能参与调控赤霉素的合成或者信号路径进而影响番茄果形。7、对STTM159a转基因植株开花当天的子房进行GA含量检测发现活性赤霉素GA1和GA3含量较野生型含量显著降低。同时对催化GA1和GA3合成的赤霉素3-β-双氧化酶（GA3ox）进行q RT-PCR检测,Sl GA3ox1和Sl GA3ox2的表达量均显著下调。进一步说明Sly-mi R159a可能通过调控Sl GA3ox1和Sl GA3ox2影响GA3合成进而调节番茄果形。8、此外,q RT-PCR检测发现Sly-mi R159a同时也受GA诱导,而靶基因Sl GAMYB1/2与此相反,说明Sly-mi R159a及靶基因可能参与GA合成与信号的反馈循环调控。综合以上实验结果说明在果实果形发育中,Sly-mi R159a可能通过其靶基因Sl GAMYB1/2参与GA合成和信号转导途径的调控,并对番茄果形形成起着重要的调控作用。
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