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组织工程技术已广泛应用于皮肤、软骨、角膜等组织的再造或者修复。然而,由于氧气及养分传输等困难,使组织工程技术在肝、肺、肾等厚组织器官再造中的应用受到很大限制。组织工程用支架材料的微血管化是解决氧气及养分传输的有效手段,对发展人工厚组织工程来说有着重要的意义,而血管新生是微血管形成的主要方式之一。据报道,细胞黏附性寡肽(如RGD等)可以通过调节内皮细胞的生长行为,促进材料诱导血管新生的能力。因此,本工作将包含细胞黏附性寡肽片段的GYIGSRG(GG)、GREDV(GV)引入海藻酸钠(ALG)中,以期获得具有诱导血管新生功能的新型活性水凝胶材料。
首先,本文通过共价修饰将GG、GV、GS(GRGDS)修饰到ALG侧链上,得到活性材料ALG-peptides(ALG-GG、ALG-GV、ALG-GS),通过核磁、红外对ALG-peptides的结构进行了表征,并通过元素分析确定寡肽接枝率均在5%左右。
其次,本文通过MTS检测法、刮痕损伤治愈法等实验考察了不同材料及寡肽修饰密度对内皮细胞黏附、迁移、增殖的影响。结果显示在中等肽浓度(0.51mM)条件下,内皮细胞在活性材料表面具有较好的生长行为。此时材料ALG-GG可显著促进内皮细胞的黏附及迁移(黏附率为86%,迁移速率为0.78μm/min),明显高于阳性对照组ALG-GS(黏附率为65%,迁移速率为0.65μm/min)。ALG-GV具有较强的促进细胞增殖的能力,培养5天后,其内皮细胞数量较阳性对照组ALG-GS高出17.8%。
在体外实验的研究基础上,本文通过以葡萄糖酸内酯/碳酸钙(GDL/CaCO3)为离子交联剂制备水凝胶,考察了不同配比对材料的机械强度、溶胀率等性质的影响。结果显示当[CaCO3]:[COO-]=0.8,[GDL]:[CaCO3]=2.0时制备的海藻酸钙复合水凝胶有最好的力学性能和较低的溶胀率。另外,通过压汞分析和墨汁染色实验,证明减压条件下(10.0 mmHg)成型的水凝胶表面和内部有较常压下更多的连通的孔道和较高的孔隙率。
将不同材料的水凝胶植入大鼠体内,培养不同时间后,通过组织切片观察和新生血管密度统计的方法,考察了材料对体内血管新生的影响。结果显示随着埋植时间的延长,周围组织和细胞开始大量长入寡肽修饰材料,且内皮细胞开始大量形成直径10-20μm的微血管,血管密度持续增长,均显著高于阴性对照组ALG;特别是当植入21 d后,材料ALG-GV的血管密度为83.7/mm2,显著高于阴性对照组ALG(42.1/mm2)和材料ALG-GG(62.4/mm2),略高于阳性对照组ALG-GS(75.3/mm2)。结合体外细胞实验可见:内皮细胞的增殖过程在血管新生过程中起着更为重要的作用,这使得材料ALG-GV具有更好的诱导血管新生的能力。
综上所述,内皮细胞在寡肽修饰活性材料ALG-GG和ALG-GV上的黏附、迁移、增殖能力均得到显著提高,且在体内具有诱导血管新生的能力;另外,材料ALG-GV对内皮细胞的增殖作用促进更明显,其在体内诱导血管新生效果亦更显著,有望为解决人工厚组织替代材料的微血管化提供帮助。