研究背景溃疡性结肠炎是临床消化内科常见疾病,发病率有逐年升高趋势,其严重降低患者生活质量并增加医疗负担。溃疡性结肠炎的发病可能与遗传、饮食过敏、感染、自身免疫、精神抑郁及焦虑等因素有关。既往研究提示ABCB1基因敲除小鼠有21%自发结肠炎,而对照组小鼠无1例发生结肠炎,这种发生在ABCB1基因敲除小鼠的结肠炎与人类溃结的发病及病理改变很相似;在药物诱导的溃结小鼠模型研究中发现ABCB1基因在结肠黏膜上皮细胞的表达及活性下调。上述动物实验提示溃结的易感性与ABCB1基因的功能有关,但这一结论仍存在争议。本文旨在通过实验研究探讨人类ABCB1基因表达水平与溃疡性结肠炎发病的关系。编码P-糖蛋白的人类ABCB1基因包含28个内含子,其中26个内含子阻断P-糖蛋白的线性表达,位于7号染色体长臂7q21.1位点上;ABCB1基因表达的mRNA长度为4.7kDa,其中编码区还占不到整条ABCB1基因mRNA核酸链长度的5%。有研究发现ABCB1基因与炎症性肠病的易感性有关。P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)是人类多药耐药基因(MDR1)的编码产物,是ATP结合盒转运载体蛋白家族(adenosine triphosphate-binding cassette family)中的最大的一个亚系,编码Pgp的基因被称为ABCB1基因(ATP-binding cassette,subfamily B)。人类的Pgp是一种ATP依赖性跨膜转运蛋白,可将细胞内的药物、毒物、代谢废物等跨膜转运到细胞外。Pgp在细胞膜的脂质双分子层可与药物分子结合并发生相互作用,然后在ATP的水解功能作用下将药物逆浓度梯度跨膜转运。亲脂性和两性分子通常是Pgp的作用底物;Pgp可在血脑屏障、睾丸毛细血管上皮细胞、肝细胞表面、肾上腺、大肠及小肠黏膜上皮细胞的刷状缘、外周血单核细胞、NK细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等多个人体正常组织表达。Pgp与正常组织细胞的分泌功能密切相关,跨膜转运功能可减少毒素从肠道吸收,并将胞内的内源性和外源性毒素通过向胆汁、尿液和肠腔分泌的方式排出体外,从而阻止了毒素在重要脏器的积聚,因此,Pgp构成了人体肠道、泌尿道、胆道的保护性屏障。在正常人体的胃肠道,Pgp在结肠和远端小肠柱状上皮细胞富集[8];Pgp在胃肠道的功能是减少内源性和外源性毒素的吸收。肝脏、肺脏、肠道和肾脏是体内最容易暴露于毒性物质的部位,而ABCB1基因表达的Pgp在上述这四个部位(器官)富集程度最高;Pgp是保护人体正常细胞免受毒物损害的重要机制之一。人为给予敲除ABCB1基因的小鼠在SPF饲养环境下可自发结肠炎,而抗生素的使用可阻断或逆转这种结肠炎的发生;所以,肠道菌群是始动并维持肠道炎症反应的必要因素;而外源性毒素排出机制丧失会促进结肠炎症的发生。肠道微生态在炎症性肠病发生发展过程中可能发挥作用。已有研究结果提示,炎症性肠病患者较健康人群肠道菌群多样性显著受损,部分益生菌减少,部分“致病菌”增加。但目前对溃疡性结肠炎患者肠道各菌种变化情况的研究结果差异较大,因此有必要对溃疡性结肠炎患者肠道微生态改变进一步研究。此外,关于肠道Pgp表达与溃疡性结肠炎患者肠道菌群改变相关性的研究尚未见报道,本研究将针对这一问题进行初步研究。目的通过本研究阐明溃疡性结肠炎患者在治疗前后较健康对照者肠粘膜ABCB1基因表达水平的变化及其对肠黏膜屏障功能的影响,为寻找溃疡性结肠炎病因提供实验理论依据。通过检测溃疡性结肠炎和健康对照者肠道细菌16SrRNA表达水平的变化,分析溃疡性结肠炎患者肠道微生物菌群构成变化。分析出肠黏膜P糖蛋白表达水平对肠道菌群变化的影响,探究ABCB1基因与肠道微生态变化的关系。方法1.通过免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR,Western blot等方法检测溃疡性结肠炎患者肠黏膜ABCB1基因表达水平的变化;溃疡性结肠炎患者治疗前后分别与健康对照者进行比较。2.检测溃疡性结肠炎患者及健康对照者血内毒素及D-乳酸水平变化,并分析ABCB1基因表达水平与血内毒素及D-乳酸水平变化的相关性,分析ABCB1基因表达水平变化与肠黏膜屏障功能改变的关系。3.通过检测溃疡性结肠炎患者及健康对照者粪便拟杆菌,双歧杆菌,乳酸杆菌,缠绕杆菌,肠球菌,梭状芽孢杆菌,脆弱杆菌菌群菌量变化情况,分析溃疡性结肠炎患者肠道微生态变化情况。通过检测粪便细菌16SrRNA完成上述实验。4.通过分析P糖蛋白表达阴性及表达阳性的健康对照者肠道拟杆菌,双歧杆菌,乳酸杆菌,缠绕杆菌,肠球菌,梭状芽孢杆菌,脆弱杆菌等七种菌群的差异,初步分析P糖蛋白表达情况对肠道微生物构成的影响。5.通过分析P糖蛋白表达阴性及表达阳性的溃疡性结肠炎患者肠道拟杆菌,双歧杆菌,乳酸杆菌,缠绕杆菌,肠球菌,梭状芽孢杆菌,脆弱杆菌等七种菌群的差异,初步分析P糖蛋白表达情况对溃疡性结肠炎患者肠道微生态变化的影响。结果1.免疫组织化学染色结果显示,溃疡性结肠炎患者肠黏膜P糖蛋白(ABCB1基因产物)表达阳性率显著低于健康对照者;溃疡性结肠炎患者治疗后肠黏膜P糖蛋白表达水平显著高于治疗前水平,但仍低于健康对照组。2.实时荧光定量PCR及Western Blot实验结果显示,溃疡性结肠炎患者肠黏膜ABCB1基因表达水平(mRNA及蛋白水平)均显著低于健康对照者;溃疡性结肠炎患者治疗后肠黏膜ABCB1基因表达水平(mRNA及蛋白水平)显著高于治疗前水平,但仍低于健康对照组;3.溃疡性结肠炎患者血内毒素及D-乳酸水平显著高于健康对照组,溃疡性结肠炎患者治疗后内毒素及D-乳酸水平较治疗前下降,但仍高于健康对照者,提示溃疡性结肠炎患者肠黏膜屏障功能受损。溃疡性结肠炎患者肠黏膜P糖蛋白表达水平与血内毒素及D-乳酸水平呈负相关。4.初治溃疡性结肠炎患者粪便拟杆菌菌量较健康对照者显著下降,差异有统计学意义;粪便双歧杆菌菌量在溃疡性结肠炎患者显著低于健康对照者;溃疡性结肠炎患者粪便乳酸杆菌菌量显著低于健康对照者;溃疡性结肠炎患者粪便缠绕杆菌菌量显著低于健康对照者,差异有统计学意义;溃疡性结肠炎患者粪便肠球菌菌量显著低于健康对照者,有统计学差异;然而,溃疡性结肠炎患者肠道梭状芽孢杆菌菌量较健康对照组显著升高,有统计学意义;溃疡性结肠炎患者粪便脆弱杆菌菌量较健康对照组显著下降,有统计学差异。5.Pgp表达阳性的健康对照者较阴性者有如下变化,粪便拟杆菌菌量升高,有统计学差异;粪便双歧杆菌菌量升高,有统计学差异;粪便乳酸杆菌菌量升高,有统计学差异;粪便缠绕杆菌菌量升高,没有统计学意义;粪便肠球菌菌量升高,有统计学差异;而肠道梭状芽孢杆菌菌量下降,有统计学差异;粪便脆弱杆菌菌量升高,有统计学差异。6.Pgp表达阳性的溃疡性结肠炎患者较阴性者有如下变化:粪便拟杆菌菌量升高,差异有统计学意义;粪便双歧杆菌菌量升高,差异有统计学意义;粪便乳酸杆菌菌量升高,差异有统计学意义;粪便缠绕杆菌菌量升高,差异有统计学意义;粪便肠球菌菌量升高,差异有统计学意义;而肠道梭状芽孢杆菌菌量下降,差异有统计学意义;粪便脆弱杆菌菌量升高,差异有统计学意义。结论我们的研究结果显示双歧杆菌,肠球菌,梭状芽孢杆菌,拟杆菌,脆弱杆菌,乳酸杆菌,缠绕杆菌等七种主要菌群均在溃疡性结肠炎患者中发生了显著变化,并且此类变化与P糖蛋白表达水平相关。结合既往研究结果,提示肠道微生态变化可能参与溃疡性结肠炎的发生发展过程。总体研究结果表明,溃疡性结肠炎患者肠道微生物多样性受损,致病菌群相对增多,益生菌及正常菌群相对减少。本研究中初诊溃疡性结肠炎患者肠粘膜炎症部位的ABCB1基因表达是下调的,无论从转录的mRNA水平还是表达的蛋白水平方面。溃疡性结肠炎患者P糖蛋白表达水平低下,导致肠粘膜屏障受损、通透性增加,诱发肠粘膜炎症反应,因此P糖蛋白低表达是溃疡性结肠炎发病的原因之一,在溃疡性结肠炎的发病过程中,P糖蛋白可能扮演了一个重要的角色。经过泼尼松治疗后,溃疡性结肠炎患者肠粘膜P糖蛋白表达上调,肠粘膜屏障功能改善,部分患者临床症状缓解。所以溃疡性结肠炎患者出现P糖蛋白高表达是应用激素后诱发的反应,不是患者自发的现象。通过本研究,有助于进一步揭示溃疡性结肠炎的发病原因,为溃疡性结肠炎的预防和治疗找到新的途径和药物作用靶点,具有一定的临床意义。溃疡性结肠炎患者在接受泼尼松治疗后,P糖蛋白水平上调,肠粘膜屏障功能改善,但仍有部分患者未能获得病情的缓解:说明P糖蛋白表达水平仅仅是参与溃疡性结肠炎发病的原因之一,尚有其他因素参与溃疡性结肠炎的发病机制。