植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是一种重要的辅助生殖技术,通过对配子或早期胚胎进行遗传学诊断,可以避免许多遗传疾病从亲代传递给子代。二十多年来,PGD在临床上得到了越来越广泛的应用。与其他辅助生殖技术一样,PGD对早期胚胎进行了体外培养和操作,其中的活检更是一种侵入性操作。大量研究发现,胚胎早期的体外操作很可能对子代健康造成负面影响。目前的临床研究尚未发现PGD中的卵裂球活检会对子代围生期和幼儿期的健康造成不良影响,但是,本实验室前期研究发现卵裂球活检后出生的小鼠在青年期存在罹患神经退行性疾病的风险。可见,系统评估PGD对子代健康的远期影响具有重要意义。由于PGD应用于临床刚二十二年,难以进行大样本的流行病学研究,更无法评估该技术对子代老年时期健康状况的影响。本实验室前期与中科院动物研究所的生殖生物学国家重点实验室合作,以小鼠为模型,探讨PGD中卵裂球活检对子代健康的远期影响。实验组的小鼠是经过四细胞期卵裂球活检、胚胎移植而出生的,也称为活检组(biopsied);对照组(control)的小鼠是经过除卵裂球活检以外与活检组一样处理而出生的。结果显示,与对照组相比,活检组雄性小鼠在老年时肺乳头状腺癌高发。本研究试图探讨其潜在的发病机制。近年来,大量研究发现DNA甲基化异常是肺癌发生早期较常见的现象,并且与肺癌的发生、进展有密切关系。另一方面,卵裂球活检恰好发生在全基因组DNA去甲基化的关键时期,很可能引起子代DNA甲基化异常。因此,我们以活检组和对照组的青年雄鼠为研究对象,应用甲基化DNA免疫共沉淀结合芯片(MedIP-CHIP)的技术检测肺组织的DNA甲基化状态。结果显示,两组之间共检测到6464个DNA甲基化差异区域,其中5863个差异区域表现为活检组相对低甲基化,占全部差异区域的90.3%,其中差异倍数大于1.5倍的有857个;另外601个的差异区域表现为活检组相对高甲基化,占全部差异区域的9.7%,其中差异倍数均小于1.5倍。聚类分析同样显示活检组青年雄鼠肺组织整体DNA甲基化水平低于对照组。说明卵裂球活检引起子代雄鼠在青年期已经出现肺组织全基因组DNA低甲基化。有研究发现,DNA低甲基化可能引起某些癌基因表达量异常增加,促进肿瘤发生。因此,我们推测这些活检组低甲基化的基因中存在与肺癌发生相关的关键基因。于是,我们重点关注活检组低甲基化、差异倍数超过1.8倍、位于基因启动子区的41个甲基化差异区域。我们应用SignalMap软件分析这41个差异区域的探针信号值,发现其中27个差异区域存在至少连续两个探针的信号值具有明显差异且趋势一致。对这27个差异区域所在基因进行Pathway分析,发现有8个基因与细胞增殖、分化、细胞周期调控以及肿瘤发生等相关,说明卵裂球活检很可能影响这些与肿瘤发生密切相关的生物学事件。进一步查阅文献,发现这8个基因中,基因Gal和Ladl已有明确文献报道与肺癌发生相关。基因Gal编码的蛋白是一种神经肽,在嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胃肠肿瘤、乳腺癌、小细胞肺癌等肿瘤中均有表达。肺癌细胞中,Gal蛋白与受体结合后,可以激活ERK1/2信号通路,参与调控细胞增殖、存活、迁移等细胞事件。基因Ladl编码的蛋白具有促进蛋白磷酸化的作用,与MEKK2相互作用,参与激活下游的MEK5-ERK5信号通路。该信号通路调控多个下游基因,如c-myc,c-fos等,参与调控细胞增殖、分化、迁移等细胞生物学过程。基因c-myc是肺癌中常发生表达量增加的一个癌基因。因此,我们推测基因Gal和Ladl可能是活检组雄鼠老年时肺癌高发的关键基因,需要进一步验证其启动子区的甲基化差异,分析其在肺癌发生中的作用。因此,我们应用亚硫酸氢盐测序验证关键基因Gal和Ladl启动子区的甲基化状态。结果显示,基因Gal启动子区甲基化水平在活检组表现为低甲基化的趋势,但是甲基化差异无统计学意义(P>0.05)。这可能是由于我们仅验证到差异区域的部分片段导致的。于是,我们应用RT-qPCR检测基因Gal的表达量,发现其在活检组雄鼠肺组织中的表达量显著高于对照组(P<0.05)。由此说明,活检组中基因Gal启动子区很可能发生了显著低甲基化,但是本实验中未能检测到。另一方面,基因Ladl启动子区在活检组青年雄鼠的肺组织中表现为显著低甲基化(P<0.05)。RT-qPCR证明,基因Lad1在活检组青年雄鼠肺组织中的表达量比对照组高出近一倍(P<0.05)。同样地,基因MEK5,ERK5,c-myc和c-fos均被检测到在活检组青年雄鼠肺组织中显著高表达(P<0.05)。基因MEK5,ERK5,c-myc和c-fos都被报道过在肿瘤组织或细胞中高表达。这些结果说明活检组雄鼠肺组织中,启动子区低甲基化引起基因Lad1表达量增加。同时,其调控的下游基因表达量增加,使活检组雄鼠老年时发生肺癌的危险性增加。综上所述,卵裂球活检引起子代雄鼠肺组织DNA甲基化模式异常,从而引起肿瘤发生相关基因的表达量改变,使子代雄鼠老年时发生肺癌的风险增加。