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青蒿是一种重要的药用植物,青蒿素是目前应用最广泛、疗效最好的抗疟疾药物。青蒿素的代谢调控研究一直是青蒿研究的重点。研究表明,青蒿在光、盐胁迫和重金属等非生物因素条件下青蒿素产量显著提高。光作为调节植物生长发育最重要的环境因子之一,参与萜类化合物合成的代谢调控。光强和光照时间的变化会影响青蒿素的积累。植物通过光敏色素,隐花色素,UV-B感光细胞等光受体响应不同的光质、光强和光周期,在青蒿中过量表达拟南芥红光受体phyb,得到的转基因青蒿对红光响应更加明显,青蒿素和青蒿酸的合成得到增加。因此,克隆青蒿隐花色素CRY1基因并转化青蒿,对探究蓝光受体对青蒿素途径的代谢调控及基因工程育种具有重要意义。本文选取高产青蒿品种为主要研究对象,从光调控、转录组测序、基因克隆、进化分析、表达分析、转基因植物功能验证等方面开展了一系列的工作。一、光参与调控青蒿素生物合成途径关键酶基因的表达,其中红光和蓝光的作用较强。研究对生长3周的青蒿幼苗进行了黑暗处理,qRT-PCR分析发现青蒿幼苗叶片中ADS、CYP71AV1和DBR2基因的表达量持续降低,黑暗转入复合光环境的植株叶片中关键酶基因的表达量逐渐提高,黑暗转入不同光质光处理结果表明,黑暗后转入红光和蓝光条件下关键酶基因的表达量提高,远红光对关键酶基因无明显作用。因此,光参与调控青蒿素关键酶基因的表达中,红光和蓝光参与调控,远红光无明显作用。黑暗后转入不同光强光照处理的实验结果表明,关键酶基因的表达受到光强大小的影响,强光照下ADS、CYP71AV1和DBR2基因表达量提高,提升效果80μmolm-2s-1>40μmolm-2s-1>10μmolm-2s-1;低光照强度环境中ADS、CYP71AV1和DBR2基因表达量降低。二、转录组测序表明蓝光可以调控青蒿素合成途径相关的转录因子,从而调控青蒿素合成代谢途径。以黑暗环境为对照,挑选40μmolm-2s-1蓝光,取样点6h、24 h三个青蒿幼苗样品,进行转录组测序。数据组装共得到206402个unigenes序列。经过注释、GO功能分类和KEGG pathway分析,结果表明蓝光参与了代谢过程,其中萜类代谢活跃。差异基因KEGG通路富集分析表明蓝光处理可以调控萜类代谢,且调控产生作用需要一定的时间。对青蒿幼苗进行差异表达谱分析,筛选与青蒿素代谢相关的差异转录因子,为169个ERF类转录因子,158个MYB家族转录因子、71个WRKY家族转录因子、97个bHLH类转录因子和79个bZIP类转录因子。蓝光可以通过转录因子调控多个参与代谢途径基因的表达,进而调控影响青蒿素的代谢。三、青蒿蓝光受体CRY1基因的克隆和分析克隆青蒿蓝光受体隐花素AaCRY1基因,生物信息学分析表明AaCRY1蛋白序列和其它植物CRY蛋白具有较高的相似性。蓝光下过表达AaCRY1的拟南芥cry1突变体幼苗,下胚轴伸长生长明显受到抑制,下胚轴长度缩短,表明AaCRY1参与蓝光介导的植物光形态建成。酵母双杂和荧光共定位实验结果表明AaCRY1可以通过和COP1的直接蛋白互作进行蓝光信号传导,调节基因表达。四、过表达青蒿AaCRY1基因能提高转基因青蒿中青蒿素生物合成途径关键酶基因的表达,从而提高青蒿素含量在青蒿中过表达青蒿CRY1基因获得转基因植株,Western blot杂交结果表明AaCRY1基因整合到了转基因青蒿的基因组中并且能成功表达翻译成蛋白。实时荧光定量分析表明转基因株系中ADS、CYP71AV1和DBR2基因的表达量显著提升,与野生型相比,ADS基因的表达量最高可提升6.4倍;CYP71AV1基因的表达量最高可提升8.1倍;DBR2基因的表达量可提高4.7倍。HPLC-ELSD分析发现转基因青蒿植株中青蒿素含量是对照的1.6-2倍,证明过表达青蒿AaCRY1基因能有效提高转基因青蒿中青蒿素含量。