肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一,约占所有原发性肝癌的90%,在男性和女性恶性肿瘤最常见致死病因中分别位于第二和第六位。我国是全球HCC发生率和死亡率最高的国家,其高度的异质性是其较其他实体肿瘤更容易发生转移、复发及耐药的主要原因。肝癌干细胞（Liver cancer stem cells,LCSCs）是存在于肝癌组织中一亚群具有启动和维持肿瘤生长能力的细胞,其具有正常干细胞特性。由于LCSCs侵袭性行为特性及其与预后的关联性,其在HCC发生发展中起到了关键作用。水通道蛋白9（Aquaporin-9,AQP9）是位于细胞膜上转运水分子跨膜运动的一种固有蛋白,据报道它还可以转运过氧化氢（Hydrogen peroxide,H₂O₂）。本课题组前期实验发现AQP9的表达通过抑制上皮间质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）从而对肝癌侵袭和转移发挥负性调控作用。另外,有研究发现胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF2）是维持CSCs特性所必需的,而IGF2和胰岛素原具有同源的氨基酸序列,有研究证明AQP9的表达可被胰岛素下调,AQP9是否受IGF2调控以及对LCSCs干性作用及机制仍不清楚。第一部分LCSCs的获得及AQP9在LCSCs中的表达和作用实验目的:探究AQP9在LCSCs中的表达及作用。实验方法:1.使用流式细胞仪无菌分选HCC CD133⁺/^-细胞,使用无血清培养富集LCSCs球。利用RT-qPCR和Western blot检测AQP9在贴壁细胞、干细胞球和CD133⁺/^-细胞中的表达。利用裸鼠皮下成瘤实验比较CD133⁺/^-细胞的皮下成瘤能力。2.构建AQP9稳定过表达细胞株,利用RT-qPCR和Western blot检测AQP9过表达对LCSCs相关基因表达的影响,无血清培养检测AQP9过表达对肝癌细胞成球能力的影响。利用免疫荧光染色检测AQP9过表达对干性基因的影响。利用平板克隆试验以及CCK8检测AQP9过表达对肝癌细胞索拉非尼敏感性的影响。3.利用siRNA在过表达AQP9细胞中敲低AQP9的表达,利用RT-qPCR和Western blot检测AQP9下调对LCSCs相关基因表达的影响,检测AQP9下调对肝癌细胞成球能力的影响。利用免疫荧光染色检测AQP9敲低对干性基因的影响。利用平板克隆试验以及CCK8实验检测AQP9敲低对肝癌细胞索拉非尼敏感性的影响。实验结果:1.通过无血清富集的LCSCs中特异性干性标志物mRNA和蛋白水平显著升高,而AQP9的mRNA和蛋白表达水平显著降低。CD133⁺细胞在无血清培养基中成球能力明显强于CD133^-细胞。CD133⁺细胞的皮下成瘤能力明显强于CD133^-细胞。2.Huh7-AQP9过表达组中LCSCs相关干性基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组。AQP9过表达抑制肝癌细胞成球能力。AQP9过表达可明显抑制肝癌细胞增殖和增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。3.AQP9表达干扰后,LCSCs相关干性基因的mRNA和蛋白水平均显著上调。AQP9抑制剂可增强肝癌细胞成球能力。敲低AQP9表达后可回复AQP9对肝癌增殖抑制作用和对索拉非尼敏感性的增强作用。实验结论:AQP9在LCSCs球和CD133⁺LCSCs中表达均明显下调,AQP9过表达抑制LCSCs干性基因表达、抑制自我更新能力及增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。AQP9的敲减可回复AQP9对LCSCs干性的抑制作用。第二部分IGF2通过抑制AQP9对LCSCs干性的作用及机制研究实验目的:探究IGF2对AQP9的调控作用及其对LCSCs特性的作用及机制。实验方法:1.利用RT-qPCR和Western blot检测IGF2预处理对LCSCs相关基因及AQP9表达的影响,无血清培养检测IGF2预处理对肝癌细胞成球能力的影响。利用免疫荧光染色检测IGF2预处理对干性基因的影响。2.无血清培养检测预处理H₂O₂、过表达AQP9、IGF2预处理、ROS清除剂NAC或BSO对肝癌细胞成球能力的影响。3.利用H2DCFDA染色检测IGF2预处理、AQP9过表达对ROS水平的影响。4.检测AQP9过表达及ROS清除剂NAC灌胃对裸鼠皮下成瘤能力的影响及瘤体干性基因表达的影响。IP检测AQP9过表达细胞加或不加NAC对β-catenin与TCF4或FOXO3a的相互作用的影响。实验结果:1.IGF2预处理可抑制AQP9的mRNA及蛋白表达,可促进干细胞相关基因的mRNA及蛋白表达。IGF2预处理回复了AQP9对干细胞相关基因蛋白表达的抑制作用。IGF2预处理组肝癌细胞成球能力明显增强,同时IGF2的预处理可回复AQP9对肝癌细胞成球能力的抑制作用。2.H₂O₂预处理明显抑制LCSCs的自我更新能力。IGF2预处理肝癌细胞后成球能力明显增强,此增强效应可被BSO预处理阻断。3.AQP9过表达增加胞内ROS水平,IGF2预处理可诱导AQP9过表达肝癌细胞中ROS水平的降低,而BSO处理可恢复IGF2对胞内ROS水平的影响。4.AQP9过表达抑制体内成瘤,通过NAC灌胃给药后成瘤体积明显增加。AQP9过表达增加ROS累积从而使β-catenin与TCF4结合减少,而其与FOXO3a结合增加,加入NAC可恢复以上效应。实验结论:H₂O₂预处理抑制LCSCs成球能力,IGF2通过抑制AQP9减少胞内ROS水平从而增强LCSCs干性,AQP9通过增加ROS水平使β-catenin与TCF4结合减少,而β-catenin与FOXO3a结合增加,最终抑制β-catenin活性而抑制LCSCs干性。