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大量研究证实,活性氧自由基(R0S)是有氧代谢过程的必然产物,并广泛参与了诸多的生理和病理过程,是自由基生物学和医学领域关注的焦点。如何快速、有效、专一地检测R0S是目前自由基研究中的一个重要目标。在诸多检测方法中,自旋捕捉技术配合电子自旋共振(Spin Trapping-ESR)是最常用、最有效的一种方法。在过去几十年中,自旋捕捉技术的发展主要集中于开发高效能的捕捉剂。在这一过程中尽管得到了一些性能优良的捕捉剂,但它们的应用仍存在许多问题,比如捕捉剂的生物分布差、生成的加合物不稳定以及不能准确反映自由基的周围环境信息等。此外,传统自旋捕捉方法的灵敏性相对较差。鉴于此,我们提出并实现了靶向自旋捕捉技术的概念,同时发展了双功能的自旋捕捉.自旋标记等功能性自旋捕捉技术:
1.借助新奇的硝酮化合物Ia-PBN我们首次实现了捕捉剂对蛋白质的靶向作用。自旋捕捉实验证实靶向作用得到的生物连接体(GS-PBN和BSA-PBN)仍有很好的自旋捕捉能力,而且GS-PBN及其自旋加合物依旧能被谷胱甘肽转运酶所识别。因此通过这种靶向连接和分子识别作用将有望实现捕捉剂在特定位置上的定位。基于此本文作者初步建立了靶向自旋捕捉技术的概念。尽管GS-PBN具有许多优良的性质,但是它却不能很好地检测生物体系中重要的超氧自由基。为此,通过相似的靶向作用得到了β-磷酰化的GS-PBN类似物——GS-PPN,解决了超氧自由基的捕捉问题。而且研究进一步发现GS-PPN以及GS-PBN的自旋加合物还能很好地反映自由基的周围环境信息。总之,GS-PPN以及GS-PBN是第一类具有自旋捕捉-自旋标记双功能性质的小分子自由基探针,它们的应用将有助于更多了解生物自由基的微环境。
2.生物膜是R0S产生的重要源头,但至今对生物膜表面自由基过程的研究却鲜有报道,原因是缺少生物膜定位捕捉技术。针对这一问题,首次合成了具有双亲性质的环状硝酮捕捉剂——DEPHdP0。在生物膜模型中的自旋捕捉实验证实DEPHdP0能够选择性地镶嵌于膜表面捕捉水脂交界面上的R0S,表明双亲性的DEPHdP0有望进一步实现生物膜界面上的定位自旋捕捉。
3.GS-PPN和DEPHdP0的捕捉效果以及相关的文献报道均证实β-磷酰化的捕捉剂能够很好地检测超氧自由基,但对此尚无系统的理论研究。为此,用实验与理论计算相结合的方法对比研究了新合成的线型β-磷酰化捕捉剂4-H0PPN和经典的线型捕捉剂PBN对超氧阴离子的捕捉反应,综合评价了磷酰化取代基对超氧自由基捕捉以及相应加合物稳定性的影响,为设计更好的捕捉剂提供了重要的实验和理论依据。
4、为了提高自旋捕捉方法的灵敏性,尝试性地合成了荧光硝酮化合物DanPPN。初步结果证实DanPPN可以有效地捕捉自由基,所得的加合物又可能通过分子内电子交换机制淬灭荧光。因此,初步实现了ESR-自旋捕捉技术和荧光方法的有利结合,即根据自旋加合物的ESR谱图可以推断自由基的分子结构,从荧光光谱可以对自由基进行定量分析。该工作将有助于实现生物自由基的定量分析及成像。