在无颌类脊椎动物七鳃鳗的神经轴体内分离纯化得到的七鳃鳗免疫蛋白(lamprey immune protein,LIP)是迄今为止在七鳃鳗体内发现的唯一一种具有免疫杀伤活性的蛋白质。本实验室前期研究发现LIP是通过识别肿瘤细胞表面脂筏微区的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白区域(GPI-APs),进而选择性杀伤肿瘤细胞,但LIP选择性杀伤肿瘤细胞的机制不清楚,本文着重探究LIP在肿瘤细胞脂筏微区中的识别靶点。分析LIP结构域功能发现LIP的N端Jacalin＿like(r LIP-?)结构域具有识别糖分子的作用;C端Aerolysin domain(r LIP-Ⅱ)结构域可以识别鞘磷脂,因而脂筏微区中的糖分子及鞘脂与LIP的相互作用关系为本文研究的重点。通过现象观察、细胞死亡率检测及免疫荧光等实验方法证明,单糖分子半乳糖、甘露糖、葡萄糖和果糖均能够封闭r LIP识别靶点,抑制r LIP的杀伤活性。ITC和Biacore技术检测发现这四种单糖中只有半乳糖和r LIP间存在微摩级相互作用,证明甘露糖、葡萄糖和果糖非特异性封闭r LIP的作用位点进而抑制杀伤。糖芯片实验结果表明LIP与两种天线型N-糖链具有相互作用。由此得出第一个结论,即r LIP与半乳糖分子存在相互作用,细胞膜GPI-APs上的N-糖链可能是r LIP的识别靶点之一;鞘脂和胆固醇作为脂筏的基本组成成分,在r LIP杀伤肿瘤细胞的识别靶点研究中也作为重要研究对象。本文使用鞘磷脂水解酶及糖鞘脂水解酶处理肿瘤细胞后进行r LIP杀伤检测,发现只有水解细胞表面的鞘磷脂可以显著性降低r LIP对MCF-7细胞的杀伤活性,因此重点探究鞘磷脂和r LIP的关系。检测发现在肿瘤细胞表面的鞘磷脂含量显著性高于正常细胞。体外人工构建脂质体微球检测发现鞘磷脂可以呈剂量依赖性方式促进r LIP对脂质体的破坏作用。Biacore再次验证r LIP与鞘磷脂之间存在相互作用。因此得出结论:脂筏中的鞘磷脂是r LIP杀伤肿瘤细胞的识别靶点。针对LIP的结构域分析,分段构建并表达了r LIP的N端的Jacalin＿like和C端的Aerolysin domain两部分原核蛋白,发现Jacalin＿like无杀伤作用;Aerolysin domain具有微弱的肿瘤细胞杀伤活性。综合本文实验结果,初步判定LIP通过识别肿瘤细胞GPI-APs的N-糖链以及肿瘤细胞脂筏微区的鞘磷脂,使LIP定位到肿瘤细胞表面,形成攻膜复合体,在细胞膜表面成孔,最终导致细胞内容物外泄细胞死亡。糖链和鞘磷脂在LIP执行杀伤功能时缺一不可。