研究背景恶性胸腔积液(malignant pleural effusion,MPE)是非小细胞肺癌(NSCLC)最严重和最常见的并发症,约有15%的非小细胞肺癌患者最初确诊时伴有恶性胸腔积液,50%的非小细胞肺癌患者最终将发展为MPE。MPE患者往往积液量大,容易复发,压迫肺组织引起呼吸困难。这是一种危及生命的并发症,临床出现MPE提示预后不佳,从确诊到死亡,其中位生存期仅为3-12个月,为此国际TNM分期标准特别地将肺癌伴有恶性胸腔积液患者划归为M1a、IV期。MPE治疗的复发率较高,国内外关于MPE的最佳治疗手段一直争议不断。国际临床指南推荐使胸水引流联合化学性胸膜固定术治疗MPE,即在肋间置管引流排尽胸水后胸腔内注射滑石粉、博来霉素、四环素等硬化剂,促使胸膜粘连、胸腔间隙消失从而抑制胸腔积液形成,滑石粉是最有效的硬化剂,其治疗成功率可达到71-100%。然而我国市面上的滑石粉均未达到医用硬化剂级别,因此国内多选取博来霉素替代。但博来霉素易引起发热、胸痛等副反应,令许多患者痛苦不堪。MPE其他方法包括限水、利尿、胸腔镜等。然而这些方法的临床效果通常较差。因此,深入了解MPE的发病机制以寻找新的安全、有效的治疗方法至关重要。MPE是宿主细胞与肿瘤细胞之间整合相互作用的结果,恶性肿瘤胸膜转移后会产生许多血管活性物质促使新血管生成和血管通透性增加,引起胸膜渗出增加。而在这些血管活性物质中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)起着核心作用。越来越多的证据表明,MPE患者胸腔积液中VEGF水平明显增高,并且胸腔积液中的VEGF水平是影响MPE患者预后的重要指标。本课题组前期研究发现三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)可通过抑制血管生成来抑制小鼠肺癌模型胸膜转移瘤的生长,并且给药后胸膜转移瘤VEGF表达降低,进一步在临床上应用ATO胸腔注射治疗MPE患者,发现胸水由最初的血性胸腔积液转变为淡黄色,胸腔积液量明显减少,胸腔积液中红细胞计数下降数倍。这提示ATO对MPE的治疗有巨大的潜在价值,但现阶段尚缺乏循证医学证据证实ATO胸腔灌注治疗MPE的有效性和安全性,ATO作用于VEGF的具体机制也尚不清楚。缺氧诱导的因子-1(hypoxia-induced factor-1,HIF-1)是肿瘤组织低氧环境中最重要的VEGF转录激活因子,而野生型抑癌基因TP53可以促进细胞中缺氧诱导的因子-1α亚基(HIF-1α)的降解,但TP53同时也是所有癌症中突变率最高的基因,突变的TP53不仅失去抑癌基因作用,还会进一步转录、翻译成为TP53癌蛋白,促进癌症发生、发展。有相关临床研究表明,TP53突变患者外周血清中检测到VEGF水平升高,TP53突变患者对VEGF抑制剂的敏感性也高于野生型TP53患者。因此,突变型TP53可能对氧感知通路有重要的增强作用。而ATO已被证明可通过改变突变型TP53蛋白的构象、促进突变型TP53蛋白泛素化降解等方式阻断突变型TP53发挥作用,因此我们推测ATO可能通过抑制突变型TP53从而下调HIF-1α–VEGF信号降低VEGF表达水平,降低胸膜血管通透性,抑制非小细胞肺癌恶性胸腔积液形成。研究目的回顾性分析三氧化二砷(ATO)与阳性对照药博来霉素治疗MPE的疗效、不良反应,明确ATO胸腔灌注治疗MPE的有效性和安全性。进一步对ATO组患者治疗前后胸腔积液进行分析,探讨ATO抑制胸腔积液形成可能的的机制。研究方法本研究的第一部分为ATO胸腔内灌注治疗非小细胞肺癌MPE的真实世界研究。纳入2015年1月至2018年1月我院呼吸科就诊的符合标准的110例恶性胸腔积液患者,在充分穿刺抽液或引流后,按照胸腔内注射药物不同分为ATO组(80例)和博来霉素组(30例),以博来霉素组为阳性药对照,给药后第6周评价ATO治疗MPE的疗效及安全性。主要结局指标为:6周客观缓解率(Objective Response Rate,ORR)。次要结局指标为:总生存期(OS),缓解持续时间(Duration of Response,Do R),不良反应,平均住院时间。第二部分为ATO抑制MPE形成的机制研究。留取ATO组部分患者治疗前及治疗后24h的胸腔积液,比较治疗前后胸腔积液红细胞计数、VEGF的水平;利用癌症基因组图谱(TCGA)收集大型非小细胞肺癌队列中基因组测序数据,分析TP53突变状态对VEGF、HIF-1α表达水平的影响;对ATO组部分患者肺癌组织病理标本行TP53免疫组化染色,明确TP53突变情况(野生型TP53蛋白正常情况下表达量极低,突变后高表达),比较TP53突变状态对MPE治疗疗效的影响。为ATO应用于临床治疗MPE提供理论依据。研究结果第一部分三氧化二砷胸腔内灌注治疗非小细胞肺癌恶性胸腔积液的真实世界研究1.6周客观缓解率:试验组(ATO组)80例,胸腔积液完全缓解(complete response,CR)10例(13.16%),部分缓解(partial remission,PR)40例(52.63%),稳定(stable disease,SD)22例(28.95%),进展(progression disease,PD)4例(5.26%),无法评价4例,客观缓解率ORR(CR+PR)为65.79%,对照组(博来霉素组)30例,CR 1例(3.33%),PR 12例(40%),SD 15例(50%),PD2例(6.67%),ORR为43.33%,两者比较差异有统计学意义(P=0.0339),结果提示ATO组客观缓解率优于博来霉素组。2.总生存期(OS)、缓解持续时间(Do R):ATO组中位OS为7.5个月(95%CI,6.966-8.034),博来霉素组中位OS为7.25个月(95%CI,5.931-8.569),两组比较差异无统计学意义(P=0.96)。ATO组中位Do R为5个月(95%CI,4.621-5.379),博来霉素组中位Do R为4个月(95%CI,2.679-5.321),两组比较差异有显著统计学意义(P=0.008),ATO组缓解持续时间更长。3.主要治疗不良反应:ATO组出现发热21例(26.25%),其中Ⅰ度18例,Ⅱ度3例;胸痛27例(33.75%),其中Ⅰ度19例,Ⅱ度3例,III度5例(6.25%);恶心/呕吐9例(11.25%),其中Ⅰ度8例,II度1例;骨髓抑制6例(7.5%),均为Ⅰ度。博来霉素组出现发热14例(46.67%),其中Ⅰ度10例,II度4例;胸痛12例(40%),其中Ⅰ度9例,III度3例(10%);恶心/呕吐7例(23.33%)Ⅰ度5例,II度1例,III度1例(3.33%);骨髓抑制3例,均为Ⅰ度。两组患者不良反应比较,ATO组发热的发生率小于博来霉素组,差异有统计学意义(P=0.041)。III度不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。骨髓抑制、恶心/呕吐、胸痛等不良反应发生率差异均无统计学意义(均P>0.05)4.住院时间:ATO组住院天数为(median,8 days[IQR,6-10]),博来霉素组患者住院天数为(median,10 days[IQR,9-11.75]),两者比较差异具有显著的统计学差异(P<0.001)。第二部分三氧化二砷通过抑制突变型TP53下调HIF-1α–VEGF信号治疗恶性胸腔积液1.ATO组16例患者治疗前及治疗后24h胸腔积液红细胞计数的变化:ATO组16例患者给药前胸水红细胞计数中位数(四分位数间距)为:4400(2050-42077.5),给药后24h胸水红细胞计数中位数(四分位数间距)为:1925(1125-12225),两者比较差异有显著统计学意义(P<0.001)。2.ATO组16例患者治疗前及治疗后24h胸腔积液VEGF蛋白水平的变化:16例患者ATO给药前胸水VEGF中位数(四分位数间距)为:210.06(162.2-270.93),给药后24h胸水VEGF中位数(四分位数间距)为:86.17(72.43-149.09),两者比较差异有显著统计学意义(P<0.001)。3.TP53突变状态对VEGF、HIF-1αm RNA表达水平的影响:突变型TP53患者VEGFA m RNA表达水平为12.28±1.01,野生型患者VEGFA m RNA表达水平为12.06±1.01,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);突变型患者HIF-1αm RNA表达水平为12.13±0.75,野生型患者HIF-1αm RNA表达水平为11.97±0.77,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。4.TP53突变对ATO治疗MPE疗效的影响:TP53突变患者13例,其中CR 2(15.38%)例,PR 7例(53.85%),6周评估胸腔积液ORR=69.23%;TP53野生型患者8例,其中CR 0例,PR 3例(37.5%),6周评估胸腔积液ORR=37.5%,虽然在此样本中TP53突变患者对ATO治疗的ORR高于野生型患者,但由于样本量较少,两者ORR相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.ATO胸腔内灌注治疗非小细胞肺癌MPE的6周客观缓解率优于博来霉素,治疗有效的患者其缓解持续时间更长,胸水复发、进展时间更晚,毒副反应发生率低,患者住院时间更短,节省医疗资源,该治疗方法可考虑临床推广。2.胸腔内ATO灌注治疗后非小细胞肺癌MPE患者胸水颜色变浅,红细胞计数下降,VEGF水平下降,提示ATO治疗MPE机制可能与降低胸膜血管通透性有关。3.与TP53野生型患者相比,TP53突变的MPE患者对ATO治疗更敏感,TP53突变组HIF-1αm RNA、VEGF m RNA表达明显升高,ATO治疗后胸水VEGF蛋白水平下降明显,提示ATO可能通过抑制TP53突变而下调HIF-1α-VEGF信号,降低VEGF水平,从而抑制胸腔积液形成。