喹乙醇(Olaquindox)是喹噁啉类抗菌促生长型饲料添加剂,因其效果好,价格低,曾被广泛用于养殖业生产中,但喹乙醇存在大量使用和滥用现象,导致其在体内的残留超标,因其具有致癌性,导致食品安全问题。欧美和日本对其禁用,我国规定小于35kg的仔猪可用,禁用于鱼和禽类,休药期35天,残留标示物为3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA),残留靶组织为肝脏。但以前所有研究并没有提供系统的喹乙醇在食品动物残留消除数据和残留标准制定的依据,因此有必要对喹乙醇的残留消除进行系统的研究。根据本实验室喹乙醇在猪,鸡、鱼和大鼠体内的放射性示踪研究结果,按VICH指南及FDA规定,确定喹乙醇的主要代谢产物为O1(N1脱一氧喹乙醇)、02(脱二氧喹乙醇)、04(N1脱氧喹乙酸)、05(脱二氧喹乙酸)、07(N4-脱一氧喹乙醇)、加上喹乙醇原形O0和原残留标示物06(3-甲基-喹噁啉—2-羧酸,MQCA)作为多残留检测对象,进行猪、鸡和鱼体内的残留消除试验,确证喹乙醇残留标示物和残留靶组织,目前国际上公认的商品组织为肝、肾、肌肉、脂肪、但结合我国居民的生活习俗也把非商品组织心、肺、胃、大肠和小肠纳入到研究范围。本课题首先合成喹乙醇6种主要代谢产物:然后以猪、鸡和鱼为研究对象,建立了喹乙醇原形和6种主要代谢产物在各商品和非商品组织中的多残留高效液相检测方法:最后,以此为基础进行喹乙醇及其代谢产物在猪、鸡和鱼体内残留消除规律的研究,并进一步对喹乙醇进行食品安全评价。通过本课题确定了喹乙醇在猪和鸡的残留靶组织为肾脏,鱼的残留靶组织为肝脏,残留标示物均为脱二氧喹乙醇,并分别按照JECFA，FDA和EMEA程序分别制定残留限量和休药期标准,为其兽药残留监控提供了科学依据,为其残留标准修订提供理论和技术支撑。1喹乙醇主要代谢物对照品的制备以喹乙醇为原料,N2S2O4为还原剂,连二亚硫酸钠以溶液的形式缓慢滴加,控制还原剂与喹乙醇之间的摩尔比为1:1,反应温度控制在50℃左右,得到两种脱一氧喹乙醇的混合物,将粗产物经硅胶层析柱层析纯化后,再用乙酸乙酯重结晶3次,其纯度达到97%。以喹乙醇为原料,N2S2O4为还原剂,连二亚硫酸钠以溶液的形式滴加,控制喹乙醇与还原剂之间的摩尔比为1:4,反应温度控制在60℃左右,反应约5小时,制得脱二氧喹乙醇,经乙酸乙酯重结晶3次后,其纯度不低于99%。以苯并呋咱(BFO)和乙酰乙酸乙酯为原料,三乙胺为催化剂,N，N-二甲基甲酰胺为溶剂,控制二者摩尔比为1:1.5,40℃反应24小时,得到中间产物3-甲基喹噁啉-2-甲酸乙酯,并以此为原料,N2S204作为还原剂进行脱氧反应,控制摩尔比为1:1,生成N1脱一氧3-甲基喹噁啉-2-甲酸乙酯,加入过量的N2S204后,则生成了脱二氧3-甲基喹噁啉-2-甲酸乙酯,然后用NaOH水解酯键得到MQCA和N1脱氧MQCA,其中MQCA经过乙酸乙酯重结晶2次后,其纯度不低于99%,然后依此为基础与甘氨酸乙酯缩合,再进一步用碱解即可得到脱一氧喹乙酸和脱二氧喹乙酸,再用乙酸乙酯重结晶2次后,其纯度不低于97%。2喹乙醇及其主要代谢物多残留检测的高效液相方法的建立根据本实验室前期放射性示踪研究结果,确定01、02、04、05和07为喹乙醇的主要代谢产物,加上原形和原残留标示物MQCA共7种化合物,建立了喹乙醇及其六种代谢产物在猪和鸡的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪、心、肺、胃、大肠和小肠以及鱼的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪、皮肤和胃肠道等商品和非商品组织中的残留检测高效液相(HPLC)方法。具体为色谱柱:Aglient ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm);流动相:A相:0.6%甲酸水,B相:乙腈;(洗脱条件为:0-5min,乙腈10%,甲酸水90%;5-25 min,乙腈30%,甲酸水70%;25.01min,乙腈10%,甲酸水90%;32min,乙腈10%,甲酸水90%)紫外检测波长320nm;进样量40μL;柱温30℃。组织样品用0.1mol/L的盐酸50%甲醇40%乙酸乙酯复合试剂提取、经正已烷去脂及HLB固相萃取小柱净化,最后用体积比为10:90的乙腈:0.6%甲酸水混合试剂复溶,HPLC检测。方法学考核表明,该方法01和02在猪和鸡的肝、肾、肌肉、脂肪、心、肺、胃、大肠和小肠及鱼的肌肉、皮肤和胃肠的定量限(LOQ)为20μg/kg,04、05、06和07在猪、鸡和鱼各组织中的LOQ为40μg/kg,00在猪、鸡和鱼各组织的LOQ为50μg/kg。添加不同定量限浓度的药物,回收率在均在63.1%-86.5%,且日间变异系数(CV)均小于12.6%。本实验建立的残留检测方法满足定量分析要求,能用于喹乙醇及其代谢产物的残留残留消除检测分析。3喹乙醇在猪、鸡和鱼体内的残留消除研究健康大三元商品猪25头,随机分为5组,连续饲喂添加100 mg/kg喹乙醇的饲料30d,20日龄科宝肉鸡30羽和健康鱼30尾,随机分成5组,连续饲喂添加50mg/kg喹乙醇的饲料30d,停药后于不同时间点宰杀一组动物,取动物的商品和非商品组织。按上述方法对组织中药物含量进行检测,结果如下:猪:停药6h,各组织均检出到原形00、01、02及MQCA,药物浓度范围分别为 108.4-212.4μg/kg,36.6-219.1μg/kg,73.7-934.0μg/kg 和 47.6-402.8μg/kg;02 在肾脏浓度最高,原形和01在猪体内消除较快。休药3d后,各组织中00和01均消除至定量限以下,肝脏和肾脏中能检测到MQCA,浓度为35.μg/kg和101.Oμg/kg,肝脏，肾脏和肺脏中检测出02,浓度分别为86.5μg/kg,293.6μg/kg和61.1μg/kg,其他组织中各药物均降到LOQ以下;休药7d后仅肾中检出02,浓度是111.0μg/kg,休药14d各组织中的药物均不能检出。由此,可以发现喹乙醇及其代谢产物在肝脏,肾脏,肌肉和肺中的残留时间均超过三个时间点,残留时间最长的化合物为02和06,残留时间最长的组织为肾脏。鸡:停药6h,和猪相比,鸡所有组织中不能检测出07,而鸡所有组织中均能检测到 00、01 和 02,浓度范围分别是 51.8-298.9μg/kg,38.2-178.1μg/kg,23.4-164.6μg/kg,且肝脏最高;休药3 d后,肝脏和肾脏中能检出02,浓度分别为57.8和57.7μg/kg;在肺中检测出01和02,浓度分别为22.0和38.5μg/kg。停药5d,在肾中检测出02,浓度为40.5μg/kg,肝脏中02的药物浓度43.6μg/kg;停药10d,各组织中检测不到任何代谢产物,可以发现喹乙醇及其代谢产物在肝脏,肾脏和肺中的残留时间均超过三个时间点,残留时间最长的化合物为01,02和06。鱼:停药6 h,和猪、鸡相比,能检测到的化合物种类明显较少,组织肝脏、肾脏、肌肉、皮肤和胃肠仅能检测到原形、02和06,而脂肪中仅能检测到00和02;停药1d,仅肝和肾中能检出02和06,浓度范围分别为39.8-62.4μg/kg,38.4-39.9μg/kg肝脏居多:胃肠中检测到02,浓度为46.2μg/kg;停药3d,所有组织中的原形和06均消除至LOQ以下;仅肝脏中有少量的02,浓度为36.3μg/kg。停药7d各组织中检测不到任何代谢产物,综上所述,可以发现喹乙醇及其代谢产物仅在鱼肝脏超过三个时间点,残留时间最长的化合物为02。4猪、鸡和鱼可食性组织中的喹乙醇最高残留限量和休药期制订本课题按照JECFA推荐的制定兽药最高残留限量(MRLs)的程序和方法,对喹乙醇在猪、鸡和鲤可食性组织中的MRLs进行核算。同时参考美国FDA和欧盟关于兽药MRLs的制定程序和方法,分别提出了三种喹乙醇的最高残留限量标准,在此基础上提出了符合我国国情的喹乙醇在猪、鸡和鲤可食性组织中MRLs。按照JECFA的程序,猪休药期为7天,鸡的休药期为10天,鱼休药期为4天;按照FDA程序喹乙醇在猪、鸡和鲤的休药期为3天;按照EMEA程序,喹乙醇在猪的休药期为14天,鸡的休药期为15天,鲤的休药期为8天。综合分析各程序的结果,按照保守的原则推荐喹乙醇在猪、鸡和鲤可食性组织中的最高残留限量为10μg/kg,在猪的休药期为14天,鸡的休药期为15天,鲤的休药期为8天。综上,本研究首次制备出喹乙醇主要代谢物的对照品,并建立喹乙醇及其6种主要代谢产物在猪、鸡和鱼商品和非商品组织中的多残留HPLC检测方法,同时,首次对喹乙醇在猪、鸡体内的残留消除规律进行系统的研究,确定了残留标示物和残留靶组织,并进一步初步提出了喹乙醇在食品动物的最高残留限量和休药期标准。研究结果为喹乙醇的药理、毒理作用,药物安全性评价和风险评估提供了基础资料,为喹乙醇的食品安全监控和不同动物的喹乙醇的代谢残留消除比较提供了科学依据,为临床安全合理用药和建立健康的养殖环境提供了理论支持。