航天失重可导致机体产生一系列飞行后心血管失调(postflight cardiovascular dysfunction,PFCD)现象,主要表现为飞行后立位耐力不良(postflight orthostatic intolerance,POI)及运动能力下降,对人类航天活动及航天员返回地面1 G重力环境后的再适应能力均造成严重影响。微重力环境暴露所致POI的发生机理十分复杂,虽经多年研究仍未完全阐明,因此,目前仍无有效的对抗措施。已有工作证实,失重/模拟失重所致动脉血管的区域特异性重建,尤其是脑动脉收缩功能增强所导致的脑血管血流量降低以及外周阻力血管收缩功能减弱所导致的血管总外周阻力(total peripheral resistance,TPR)下降,可能是导致POI发生的主要机制之一。因此,研究失重/模拟失重条件下机体动脉结构和功能的区域特异性重建对于阐明POI的发生机理并提出具有针对性的对抗措施均有重要意义。前期研究表明,多种机制可能共同参与失重/模拟失重所致动脉结构与功能重建的调节,包括血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)离子通道重塑、局部肾素-血管紧张素(local renin-angiotensin system,L-RAS)系统、活性氧(reactive oxygen spices,ROS)、一氧化氮-一氧化氮合酶(nitric oxide-nitric oxide synthase,no-nos)通路以及炎性反应等。大量血管生物学研究证实,rhoa-rho激酶(rhokinase,rho-associatedcoiled-coilformingkinase,rock)通路在上述各机制的调节中均发挥了重要作用。rhoa是rho蛋白家族成员之一,除调节肌动蛋白细胞骨架的作用外,还参与调节多种细胞功能,如细胞收缩、运动、增殖和凋亡等。rock即rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶,是研究最为广泛的rhoa下游效应分子,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。目前,有关rhoa-rock通路在高血压、动脉粥样硬化等多种心血管疾病血管收缩反应异常中的调节作用已得到广泛证实,且我们的前期研究亦初步证实rock在模拟失重大鼠大动脉收缩功能改变中可能发挥重要作用,因此,我们推测,rhoa-rock通路可能作为核心环节,协调上述多种可能参与失重/模拟失重所致动脉重建的通路机制,共同介导模拟失重大鼠动脉血管尤其是阻力血管结构与功能重建的发生。本研究采用28天尾部悬吊(hindlimbunweighted,hu)模拟失重大鼠模型模拟失重对大鼠心血管系统的影响,以股动脉(femoralartery,fa)、基底动脉(basilarartery,ba)和肠系膜3级小动脉(third-ordermesentericartery,ma)为研究对象,分别检测其受体和非受体介导的动脉收缩功能改变及rhoa-rock通路在其中发挥的作用。同时,我们进一步深入研究rhoa/bkca通道之间的结构和功能联系及其在模拟失重所致动脉功能重建中的作用机制。最后,我们初步探讨caveolae/rhoa/bkca三者之间共定位结合并组成vsmcs表面缓冲系统(bufferingsystem)从而代偿外界应力改变的可能性。本研究主要结果如下:(1)hu显著降低大鼠股动脉中rock的表达并抑制其活性(1)与对照组(control,con)大鼠相比,hu大鼠fa中苯肾上腺素(phenylephrine,pe)和氯化钾(potassiumchloride,kcl)诱导的收缩反应均显著降低。(2)应用rock特异性抑制剂y-27632可同等程度抑制con和hu大鼠fa收缩功能。(3)hu显著降低fa中rockii的表达及肌球蛋白轻链磷酸酶(myosinlightchainphosphatase,mlcp)、肌球蛋白轻链(myosinlightchain,mlc)的磷酸化水平,并显著增强p65核转位及诱导型一氧化氮合酶(induciblenos,inos)的表达。(4)hu显著增加fa组织中no的产量,且y-27632可显著放大该效应。(2)rhoa-rock通路在模拟失重大鼠脑动脉、肠系膜小动脉等阻力血管收缩功能改变中可能发挥代偿性保护作用(1)与con大鼠相比,pe、五羟色胺(serotonin,5-ht)及kcl诱导的收缩反应在hu大鼠ba中均显著增强,在ma中均显著降低。(2)除5-ht诱导的con大鼠ba收缩功能外,y-27632可显著抑制两组大鼠ba和ma的收缩反应,且与con大鼠相比,y-27632对hu大鼠ba收缩功能的抑制程度显著降低,而对ma的抑制程度则显著增强。(3)y-27632显著增强5-ht诱导的con大鼠ba的收缩反应。(4)与con大鼠相比,u-46619介导的收缩反应在hu大鼠ba中显著降低,而在ma中显著增强。(5)hu导致rhoa-rock通路蛋白表达及活性在ba和ma中发生不同程度的变化,具体表现为,在ba中rhoa、rock的表达不变但活性降低,而在ma中二者的表达及活性均显著增强。(3)rhoa/bkca复合体可能作为缓冲系统共同代偿模拟失重所致阻力动脉收缩功能重建(1)与con大鼠相比,bkca通道α和β亚基蛋白表达在hu大鼠ba中显著增强,在ma中未见显著改变。(2)免疫共沉淀结果显示,当以rhoa作为目标分子进行靶向捕获时,可在大鼠ba中同时检测到bkca通道α和β亚基的表达,而在ma中仅检测到β亚基的表达,且hu显著上调上述bkca通道亚基蛋白的表达水平。(3)当以bkca通道β亚基作为靶分子进行捕获时,在大鼠ba和ma中均可检测到rhoa的表达,且hu亦显著增强两种动脉组织中rhoa的表达水平。(4)激光共聚焦实验进一步证实上述结果,与con大鼠相比,hu大鼠ba和ma中rhoa与bkca通道α/β亚基之间的融合荧光显著增强,且更加规则并更加趋近于细胞膜和细胞两极。(5)在体外构建的bkca通道过表达hek293t细胞模型中亦发现,以rhoa或bkca通道β亚基作为目标分子进行靶向捕获时,均可检测到对方的表达,且仅在β亚基存在的情况下,才能检测到α亚基的表达。(6)全细胞膜片钳结果表明,使用选择性rhoa抑制剂肉毒杆菌c3外酵素(clostridiumbotulitumc3exoenzyme,c3)可显著增强bkca通道电流密度,而rhoa激动剂u-46619则显著抑制bkca通道电流密度。(7)hu显著降低大鼠主动脉vsmcs中小窝结构(caveolae)的数量,但并未影响其结构蛋白caveolin-1(cav-1)的表达。(8)当以cav-1作为靶分子进行捕获时,可在大鼠胸主动脉(thoracicaorta,ta)和腹主动脉(abdominalaorta,aa)中同时检测到rhoa及bkca通道α/β亚基的表达,且hu可显著降低两种主动脉中rhoa的共定位表达。在TA中,HU亦显著降低α亚基的共定位表达而显著增强β亚基的表达。相反,在AA中,HU可显著增强α亚基的表达而显著降低β亚基的表达。以上结果表明:1)28天模拟失重显著降低ROCK的表达及其对下游靶通路的作用,包括与股动脉收缩反应性直接相关的MLCP/MLC通路,以及间接相关的NF-κB/iNOS/NO通路,二者可能共同导致模拟失重大鼠股动脉收缩功能降低;2)RhoA与BKCa通道之间存在共定位结合关系,且模拟失重可能通过改变二者之间结合方式以及结合程度的形式代偿大鼠阻力动脉功能重建;3)Caveolae/RhoA/BKCa通道可能作为经典的VSMCs表面缓冲系统的补充,共同发挥代偿外界应力改变对VSMCs不利刺激的保护性作用。