论文部分内容阅读
干细胞存在于机体胚胎及成体的各种组织中，是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，其中成体干细胞（adult stem cells, ASCs），尤其是间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）能支持机体多种组织器官生理性的持续更新过程，并参与疾病或损伤时组织再生和修复。我们已经成功地从胎儿和成人的多种组织及小鼠骨髓的MSCs培养体系中分离得到Flk1+MSCs，它们具有稳定的表型特征，即Flk1、CD29、CD44、CD105阳性，内皮细胞特征性表型von Willebrand（vWF）、CD31和造血细胞的表型CD34、CD45、CD11a、CD11b和HLA-DR阴性；能向三个胚层的细胞分化；并且已在多个疾病损伤模型中证实它能参与组织损伤修复。更为重要的是，慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）、再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）、多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）、骨髓增殖异常综合征（meylodysplastic syndrom, MDS）患者的骨髓中也含有具有相同表型特征的Flk1+ MSCs，它们或作为白血病干细胞（leukemia stem cells, LSCs）存在参与CML的发生，或因其分化潜能或免疫调节功能的异常参与疾病进展。以上说明：Flk1+ MSCs不仅在组织损伤和修复中发挥重要作用，其生物学特性的异常改变可能还是一些疾病发生、发展的干细胞水平的机制。放射治疗是目前临床上常用的一种肿瘤治疗方法，但它除了能杀灭肿瘤细胞外，也往往损伤正常组织，如骨和骨髓等，导致放射相关的一系列近期和远期并发症。已有报道，放射诱导的造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）衰老是放射后长期骨髓造血功能损伤的潜在机制。但骨髓中不仅含有HSCs，还含有MSCs，它能分化为骨髓基质的多种细胞成分，构成HSCs龛位（niche）。其中由骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）分化而来的成骨细胞，不仅参与骨组织的构成，还是HSCs龛位的关键细胞成分。因而我们应用全身照射（total body irradiation,TBI）小鼠模型进行了以下实验，观察TBI对小鼠Flk1+BMMSCs生物学特性的影响及其意义。本研究第一部分旨在观察Flk1+BMMSCs在放射损伤后细胞衰老相关的细胞和分子水平指标的变化。结果显示：在接受单一剂量4Gy的TBI后，小鼠Flk1+BMMSCs并未表现出细胞衰老相关的形态学、衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）活性的改变以及细胞周期阻滞现象，相反地，TBI后第3天，较多的Flk1+BMMSCs进入S期。同时，TBI也未能诱导细胞衰老相关基因p16INK4a、p21cip1／waf1、p53和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）表达上调。鉴于成骨细胞在骨骼和HSCs龛位中的重要作用，在第二部分的实验中我们研究了TBI对小鼠骨髓间充质干／祖细胞池大小及其成骨分化潜能的影响。4Gy的TBI后，小鼠骨髓间充质干／祖细胞池明显缩小，表现为成纤维细胞集落形成单位（colony-forming unit fibroblast,CFU-F）数量迅速减少，4周内未见恢复。向成骨细胞分化的Flk1+BMMSCs碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和Von Kossa染色及成骨分化相关基因：核心结合因子1（core-binding factor 1, Cbfa1）、Ⅰ型胶原（type 1 collagen,Col1）、骨钙蛋白（osteocalcin, OC）和骨桥蛋白（osteopontin,OPN）在TBI前后不同时间点的表达变化均说明Flk1+BMMSCs的成骨潜能在TBI后第3天明显增强，随后成骨细胞分化、成熟障碍。这一改变可能与BMMSCs上具有PDZ结合基序的转录共激活基因TAZ（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif）的表达变化相关。在第三部分的实验中我们观察了TBI后小鼠体内成骨细胞、骨骼系统以及HSCs骨龛（osteoblastic niche）的改变。我们发现，TBI后体内成骨细胞数量显著减少，骨组织结构破坏明显，TBI后第15周时，TBI小鼠全身骨密度（bone mineral density, BMD）明显降低。纺锤形的、表达神经-钙黏附素的成骨细胞（spindle-shaped N-cadherin-expressing osteoblasts, SNOs）被认为是HSCs骨龛中的关键细胞成分，TBI后其数量亦明显减少。总之，通过以上实验研究，我们证实4Gy TBI不能诱导小鼠Flk1+BMMSCs发生细胞衰老；但骨髓间充质干／祖细胞池显著缩小；TBI后早期Flk1+BMMSCs进入S期增多，成骨分化潜能明显增强，随后细胞周期逐渐恢复，成骨分化能力显著降低。TBI诱导的Flk1+BMMSCs数量、细胞周期状态及成骨潜能的动态改变提示在TBI后早期Flk1+BMMSCs存在一定的代偿，但最终Flk1+BMMSCs数量和成骨分化能力的显著降低可能是TBI后骨骼和造血系统长期损伤的干细胞水平的机制。