大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是常见的化脓性感染病原体,可以引起皮肤、皮下软组织、深部组织的化脓性感染乃至内脏器官的脓肿,也能引起脓毒血症。常对多种抗生素呈不同程度的耐受。在临床检验诊断中,快速准确的检测出病原微生物至关重要。现有的检测方法有分离培养法、免疫学检测法和分子生物学检测方法。目前在临床应用中分离培养法还是菌种检测的金标准,但其耗费时间长,操作繁琐,对检测人员要求较高；免疫学检测法麻较烦需要专门的技术和工具。故本研究从分子生物学角度探索大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的检测方法,建立了四种病原体的PCR检测体系以及表皮葡萄球菌的LAMP检测。本研究对大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌进行生物信息学分析,筛选出其特异基因。大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌各筛选出基因分别为：LafF(GI:12887815)、TranR(GI:13347275)和 PurE(GI:12329975),表皮葡萄球菌筛选出两个基因为：LysE(GI:3240523)和DeoR(GI:3240916)。针对特异基因设计引物,在单重PCR扩增中,对Mg2+浓度和退火温度进行优化,得到每对引物最佳的Mg2+浓度和退火温度的组合,选择优化好的条件进行扩增,评价检测体系的特异性和灵敏度。利用单重PCR方法对大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌各10株,肺炎克雷伯菌、弗劳地氏枸橼酸杆菌、伤寒杆菌、琼氏不动杆菌、溶血葡萄球菌和摩氏摩根菌各3株进行检测,结果显示只有大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌出现了相应的预期大小的目的条带,其它菌株并未出现任何条带。这表明该检测体系具有非常好的特异性。利用单重PCR方法对大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌分别进行梯度检测,结果显示大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌检测下限可达到2个/反应。这表明该检测体系具有很高的灵敏度。进行多重PCR扩增时,在单重PCR条件优化的基础上,筛选合适的Mg2+浓度和退火温度组合,最终确定50μL反应体系的反应条件为：Taq酶(5U/μL) 0.3μL、dNTP混合物(2.5mM)4μL、10×PCR Buffer 5μL、MgCl2(25mM)3.2μL、四种菌的上、下游引物(10μM)各2μL,反应的退火温度为57℃,延伸时间为20秒。在上述反应条件下,评价此多重PCR检测体系的特异性和灵敏度。反应结果显示大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均能扩增出目的条带；大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌多重PCR检测的下限为2个／反应。我们还应用LAMP等温扩增的方法对表皮葡萄球菌的DeoR(GI:3240916)基因进行鉴定,通过优化反应条件,建立了LAMP检测体系。最终确定25μL反应体系的反应条件为：Bst酶0.5μL、10×Thermpol 2.5μL、MgCl2(25mM) 4μL、dNTP混合物(2.5M) 4μL,内引物FIP和BIP各2μL、外引物F3和B3各0.5μL、甜菜碱(16mol/L)2.5μL,反应温度为65℃,反应时间为75分钟。反应结果显示只有表皮葡萄球菌出现扩增产物,其它菌种并未出现,表明该环介导等温扩增建测体系有较好的特异性；表皮葡萄球菌的检测下限为2个/反应,表明该环介导等温扩增建测体系有较高的灵敏度。总之,我们通过PCR和LAMP手段对常见化脓性感染病原体大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌进行快速检测,检测用基因为首次应用于各自菌种鉴定,建立的检测方法简单、快速、灵敏度和特异性高。