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背景:自噬是机体抵抗应激、提高生存能力的重要过程。脑缺血发生后,胞内衰老和受损的成分可经自噬降解产生代谢底物被循环利用,帮助细胞维持能量稳态并提高生存率。作为中枢神经系统中主要的细胞类型,脑缺血后星形胶质细胞可通过激活自噬改变其存活及功能状态,从而对改善卒中后脑损伤及神经功能发挥重要作用。unc-51样激酶1(Unc-51 like kinase 1,ULK1)是启动自噬的关键蛋白,雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)可通过磷酸化ULK1的丝氨酸757位点抑制其活化。既往研究表明,应激条件下激活的AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)可以解除m TOR对ULK1的抑制作用,从而促进自噬发生。然而,目前关于缺血后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1通路对自噬调控的相关研究尚少。此外,选择性自噬是细胞对胞内特定成分的选择性清除,目前有许多研究涉及丝氨酸757位点磷酸化的ULK1(p S757-ULK1)对自噬的调控,却很少有研究探索自噬对p S757-ULK1的反向调控。因此,我们试图通过观察缺血后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1通路的变化、p S757-ULK1的自噬降解及它们对自噬的调控,探索其对缺血性脑损伤的神经保护作用,并为缺血性脑卒中的治疗提供新靶点。丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)是中药丹参中的主要活性成分。已有研究报道Sal B在心肌细胞、肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞中对自噬有促进作用。但Sal B对脑缺血后星形胶质细胞的自噬调控作用及机制尚不明确,需要我们进一步探究。目的:明确自噬对缺血性脑损伤的神经保护作用,验证缺血性脑损伤后星形胶质细胞AMPK/m TOR/ULK1通路对自噬的调控作用,同时探索Sal B的神经保护作用及机制。方法:体内实验中,选用体重为20-23g的成年雄性C57BL/6小鼠,建立左侧大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。实验分为假手术组、MCAO组、Sal B干预组、自噬抑制剂巴弗洛霉素(Bafilomycin A1,Baf A1)干预组、Sal B+Baf A1干预组。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色评价各组小鼠脑梗死体积情况;通过Longa评分评估各组小鼠神经行为学评分情况。体外实验中,培养新生C57BL/6小鼠皮层星型胶质细胞,以糖氧剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型为基础,实验分为对照组、OGD组、Sal B干预组、Baf A1干预组、Sal B+Baf A1干预组、AMPK抑制剂多索吗啡(Dorsomorphin)干预组和Sal B+Dorsomorphin干预组。应用噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测各组细胞存活率;应用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;应用流式微珠阵列(Cytometric bead array,CBA)法检测各组细胞炎性细胞因子的释放情况;应用免疫印迹法检测各组细胞中自噬标志物Beclin 1和LC3B蛋白以及AMPK/m TOR/ULK1通路相关蛋白的表达情况,检测应用si RNA技术分别敲低选择性自噬受体NDP52、OPTN、NBR1和p62的基因后细胞中p S757-ULK1的表达变化;应用免疫共沉淀技术分别评价p S757-ULK1与NDP52和OPTN之间的连接情况;应用免疫荧光染色分别观察p S757-ULK1与NDP52和OPTN的共定位情况。结果:1.组织形态学及神经行为学评分:与MCAO组相比,Sal B干预组的脑梗死体积显著减小(p<0.0001),Longa评分有减小趋势,但无统计学差异;与Sal B干预组相比,Sal B+Baf A1干预组的脑梗死体积明显增加(p<0.001),Longa评分有增加趋势,但无统计学差异。2.细胞存活及功能状态:与对照组相比,OGD组的细胞存活率降低(p<0.001),凋亡比率增加(p<0.001),促炎因子IFN-γ、IL-2和IL-6的水平增高(p<0.01),抗炎因子IL-4和IL-10的水平减低(p<0.05);Sal B干预剂可明显提高细胞存活率(p<0.01),降低细胞凋亡比率(p<0.001),减少细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6(p<0.01)并增加IL-4和IL-10的释放(p<0.05),明显改善细胞的存活及功能状态;而给予自噬抑制剂Baf A1可逆转Sal B对细胞存活及功能方面的保护作用。3.自噬相关蛋白及调控分子的改变:与对照组相比,OGD组细胞内自噬标志物Beclin 1表达、LC3B II/LC3B I比值(p<0.001)和p T172-AMPK的表达明显增加(p<0.01),p S2448-m TOR、p S757-ULK1的表达明显降低(p<0.05);对于OGD组,给予Sal B处理可进一步增加Beclin 1(p<0.05)和p T172-AMPK的表达(p<0.01),增大LC3B II/LCB I比值(p<0.05),并减少p S2448-m TOR和p S757-ULK1的表达(p<0.01),表明Sal B激活AMPK/m TOR/ULK1通路并增强自噬活性;此外,给予Sal B干预组AMPK抑制剂Dorsomorphin处理可逆转上述蛋白改变。4.自噬介导p S757-ULK1降解:给予OGD组和Sal B干预组自噬抑制剂Baf A1处理后,胞内p S757-ULK1出现蓄积(p<0.05),且Sal B干预组中p S757-ULK1蓄积更明显,表明Sal B可促进p S757-ULK1的自噬降解;选择性自噬受体NDP52和OPTN敲低后,p S757-ULK1蓄积明显(p<0.01),表明p S757-ULK1的选择性自噬降解可能由自噬受体NDP52和OPTN介导;此外,免疫共沉淀结果显示Sal B处理可以使p S757-ULK1与星形胶质细胞中内源性的NDP52和OPTN之间的连接增加。免疫荧光结果显示Sal B处理可以使p S757-ULK1与He La细胞中外源性的NDP52和OPTN之间的共定位增加。结论:1.脑缺血损伤后星形胶质细胞中自噬活性的增强可促进其存活,减少其促炎因子并增加其抗炎因子的释放。2.脑缺血损伤后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1信号通路的激活可增强其自噬活性,同时自噬促进由NDP52和OPTN介导的p S757-ULK1的选择性自噬降解,形成正反馈型保护环路。3.Sal B通过激活星形胶质细胞AMPK/m TOR/ULK1信号通路及促进p S757-ULK1的自噬降解,增强星形胶质细胞的自噬活性,进而在脑缺血损伤中发挥神经保护作用。