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血栓性疾病是一类因多种原因引起的血管内血栓形成,使心脏、脑、肺或其它重要组织和器官缺血或梗死,进而导致器官功能受损,致残或死亡的疾病,具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点,严重的危害人类生命健康。抗血栓药物治疗是血栓性疾病主要的管理手段。然而,目前常用的抗血栓药物具有疗效不稳定、出血风险大和需要持续进行凝血功能监测等缺点。因此,临床亟需开发更有效和更安全的抗血栓药物用于血栓性疾病的预防和治疗。我国用活血祛瘀类中药治疗血栓相关疾病有着悠久的历史。血竭（Daemonorops Draco）是传统的活血祛瘀中药,在《本草纲目》中被誉为“活血圣药”。中医认为其具有活血定痛和化瘀消肿等功效。临床和基础研究均表明其具有抗血栓的作用。然而其发挥抗血栓作用的有效成分及作用机理尚不清楚。血小板的活化在病理性血栓的形成中起到重要的作用。血小板活化后会释放三磷酸腺苷（adenosine trisphosphate,ATP）,ATP的生物发光分析通常被用于检测血小板活化。然而,现有的ATP生物发光分析方法具有线性差和发光信号衰减快的缺点,不能准确地测定出血小板活化后ATP的释放量以及用于高通量筛选血小板抑制剂。本研究拟首先建立防治血栓性疾病的新型血小板抑制剂的高通量筛选方法（血小板释放ATP的生物发光分析方法）,然后利用优化后的ATP分析法并结合血小板活化和血栓形成的分子机制,从血竭中筛选对血小板活化有特异性抑制作用的单体化合物,并探索其作用机理,以期发现活性强且不良反应少的抗血栓前体药物。首先,建立血小板释放ATP的生物发光分析方法:向缓冲液A反应体系中添加辅酶A（coenzyme A,CoA）以解决ATP生物发光分析方法线性差的问题。然后测定CoA对汉克平衡盐溶液（hank’s balanced salt solution,HBSS）和Tyrode’s缓冲液中ATP生物发光分析方法的影响。然后向HBSS和Tyrode’s两种缓冲液中添加牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）,以解决ATP生物发光分析方法的发光信号衰减快的问题。最后分析BSA减缓信号衰减的原理以及利用该方法高通量筛选血小板抑制剂可行性。结果表明,CoA显著提高HBSS和Tyrode’s缓冲液中ATP分析的发光强度和标准曲线线性。BSA显著延缓两种缓冲液中ATP分析的发光信号衰减。此外,利用优化后的ATP生物发光分析方法可以准确地测定血小板活化后ATP的释放量且Z因子大于0.5,并能准确地评估Ly294002和Staurosporine对血小板活化的抑制作用。因此,优化后的血小板释放ATP的生物发光分析方法,具有发光信号强、线性高（准确性高）和信号衰减慢（稳定性强）的优点,适用于高通量筛选血小板抑制剂。然后,从血竭中筛选具有抗血小板作用的化学成分:本课题组其他成员前期对血竭进行了提取、分离和纯化,从中得到了 4种粗提物和21个单体化合物。本研究中我们利用优化后的ATP分析方法对血竭提取部位和21个单体化合物进行抗血小板活性成分筛选。结果表明,血竭总提取物、水提取物、石油醚提取物和乙酸乙酯提取物对凝血酶诱导的血小板ATP释放具有很强的抑制作用,其IC50分别为0.92±0.10、0.98±0.10、2.35±0.07和3.27±0.30 μg/mL。21个单体化合物中,有9个化合物对凝血酶诱导的血小板ATP释放表现出较强的抑制作用。其中,化合物11的抑制作用最强,其IC50为7.8±0.7μM。化合物 1、7 和8 次之,其 IC50分别为 11.2±0.9、18.7±0.5 和 22.4±5.1μM。化合物4、5、9、13和16的抑制作用最弱,其IC50分别为59.7±2.1、31.1±6.5、51.0±0.6、40.2±14.7和41.1±4.2μM。其余的化合物在100 μM剂量下对血小板ATP释放的抑制率没有达到50%。然后,进一步测定4种粗提取物和化合物（1、4、5、7、8、9、11和16）对血小板聚集的影响。结果表明,血竭总提物、石油醚提取物和化合物4、7、8、11、16对血小板聚集有一定的抑制作用,其中化合物8（编号为XJ-8）对血小板聚集的抑制作用最强,这说明血竭中存在丰富的抗血小板活性成分,其中黄烷衍生物XJ-8对血小板活化具有较强的抑制作用,具有抗血小板和抗血栓的潜力。最后,探讨血竭中黄烷衍生物XJ-8的抗血小板和抗血栓作用及分子机制:在细胞水平上,测定其对血小板活化、颗粒释放、膜蛋白表达、聚集以及凝块收缩的影响。同时测定其对凝血三项（活化部分凝血酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time,PT）和凝血酶时间（thrombin time,TT））的影响。在整体水平上,利用小鼠尾部出血模型和三氯化铁(ferric trichloride,FeCl3诱导的大鼠颈总动脉血栓模型,测定其体内抗血栓的作用。在分子水平上,选取血小板活化过程中起重要作用的55个蛋白激酶和同工酶,并利用蛋白激酶测定方法,测定XJ-8对它们的直接抑制作用。最后利用Western Blot方法,对XJ-8直接抑制的蛋白激酶介导的血小板活化信号通路进行进一步分析。体内实验表明,XJ-8选择性地抑制胶原和凝血酶诱导的血小板ATP释放和血小板聚集,对整合素αⅡbβ3活化和CD62P释放无明显抑制作用。XJ-8没有延长APTT、PT和TT的作用,不影响血小板的收缩功能。体内实验表明,XJ-8显著抑制FeCl3诱导的大鼠颈总动脉血栓形成和延长小鼠尾部出血时间。分子机制研究发现,XJ-8选择性地抑制丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3,MAP3K3）。XJ-8 对 MAP3K3 的抑制率随着 XJ-8 的浓度增加缓慢增加,且最大抑制率不超过50%,说明XJ-8是一个中等强度的MAP3K3选择性抑制剂。Western Blot结果表明,XJ-8显著下调胶原和凝血酶诱导的丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase,MEK）1/2、胞外信号调节激酶（extracelluar signal-regulated kinase,ERK）1/2 和蛋白激酶 B（protein kinase B,PKB/AKT）S473 的磷酸化水平。因此,XJ-8抗血栓的作用机理可能是:通过抑制新型抗栓靶点MAP3K3及其下游MEK1/2-ERK1/2和AKT信号通路发挥抗血小板和抗血栓作用。本研究首先建立了一套稳定、可靠的血小板活化测定方法,为高通量筛选用于预防和治疗血栓性疾病的新型血小板抑制剂奠定了方法学基础。然后利用该方法,对血竭提取部位及21个单体化合物进行抗血小板活性成分筛选,发现一批具有抗血小板作用的单体化合物,其中黄烷类衍生物XJ-8对血小板的活化具有较强的抑制作用。在此基础上,进一步研究发现XJ-8是通过抑制新型抗栓分子靶点MAP3K3及其下游MEK1/2-ERK1/2和AKT信号通路发挥抗血小板和抗血栓作用。XJ-8是首个被发现的中等强度的、高选择性的MAP3K3抑制剂,这为开发用于防治血栓性疾病的MAP3K3抑制剂提供了先导化合物。本研究丰富了活血祛瘀中药的科学内涵,也为从活血祛瘀类中药中筛选活性强且不良反应少的新型抗血栓药物提供了研究思路和新的先导化合物。