皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC,简称鳞癌)是起源于表皮角质形成细胞或皮肤附属器鳞状上皮细胞的恶性肿瘤,是常见的皮肤恶性肿瘤之一,其发病率约占全部非黑素性皮肤恶性肿瘤的20％。随着Mobs手术的应用和推广,绝大部分皮肤鳞癌的治疗可获得较好的疗效。然而,对于某些不适于接受皮肤外科治疗(如:皮损泛发或面积较大者、损害发生于外阴等特殊部位、高龄伴手术禁忌症患者等)、预防皮损复发及器官移植术后并发皮肤鳞癌,选择有效的药物进行干预显得非常重要。　　 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是临床上应用较广的一种传统中草药,具有广泛的生物学活性(包括抗菌、抗病毒、解热镇痛、抗变态反应、抗肿瘤、抗氧化及治疗心血管疾病等作用)。药理学研究表明,黄酮类化合物是黄芩的主要有效成分,其中含量较高并具有明显药理作用的是黄芩苷(baicalin,C21Hi8O11)、汉黄芩苷(wogonoside,C22H20O11)、黄芩素(baicalein,C15H10O5)和汉黄芩素(wogonin,C16H1205)4种。目前国内外研究表明,黄芩可以诱导多种肿瘤细胞凋亡;但黄芩能否诱导人皮肤鳞癌细胞凋亡以及凋亡的信号转导机制尚未阐明。　　 本研究以人皮肤鳞癌SCL-1、SCL-12及SCL-13细胞株为靶细胞,观察三种黄芩衍生物(黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素)在体外对人皮肤鳞癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用,并探讨其凋亡的分子调控及信号转导机制;观察黄芩衍生物联合阿维A酸对人皮肤鳞癌细胞的协同抑制作用及作用机制,从而为黄芩治疗皮肤鳞癌的临床应用提供有价值的依据。　　 材料与方法：　　 1、细胞培养SCL-1细胞、HaCaT细胞生长于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中；SCL-12、SCL-13细胞生长于含20％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中；所有细胞置于5％CO2、37℃孵箱中传代培养。　　 2、MTT法测定细胞增殖活性。　　 (1)黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对SCL-1、SCL-12及SCL-13细胞增殖的影响；　　 (2)黄芩素对HaCaT细胞增殖的影响；　　 (3)阿维A酸对SCL-12细胞及HaCaT细胞增殖的影响；　　 (4)黄芩素、阿维A酸单独及联合应用对SCL-12细胞增殖的影响；　　 3、Annxin V和PI结合实验检测细胞早期凋亡(1)Annxin V和PI结合实验检测黄芩素诱导SCL-12细胞及HaCaT细胞凋亡的早期凋亡率；　　 (2)Annxin V和PI结合实验检测黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素诱导SCL-12细胞凋亡的早期凋亡率；　　 (3)Annxin V和PI结合实验检测黄芩素、阿维A酸单独及联合应用诱导SCL-12细胞凋亡的早期凋亡率；　　 4、Cell Death Detection ELISA kit检测细胞凋亡　　 (1)黄芩素对SCL-12细胞的凋亡诱导作用；　　 (2)黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对SCL-12细胞的凋亡诱导作用；　　 (3)黄芩素、阿维A酸单独及联合应用对SCL-12细胞的凋亡诱导作用；　　 5、流式细胞仪检测细胞周期　　 (1)黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对SCL-12细胞周期的影响；　　 (2)黄芩素、阿维A酸单独及联合应用对SCL-12细胞周期的影响；　　 6、流式细胞仪检测黄芩素诱导SCL-12细胞膜表面分子Fas表达　　 7、流式细胞仪检测黄芩素诱导前后SCL-12细胞线粒体膜电位的改变　　 8、凋亡的形态学观察　　 (1)丫啶橙荧光染色观察黄芩素对SCL-12细胞形态的影响；　　 (2)倒置相差显微镜下观察黄芩素、阿维A酸单独及联合应用对SCL-12细胞形态的影响；　　 9、实时荧光定量RT-PCR检测SCL-12细胞Fas,FasL mRNA表达　　 10、Western blot分析　　 (1)Western blot检测黄芩素诱导前后SCL-12细胞Fas死亡受体途径中主要蛋白(Fas,FasL,FADD,PARP,caspase-8,-9,-3)的表达及活化情况；　　 (2)Western blot检测黄芩素、阿维A酸单独及联合应用对SCL-12细胞caspase-8,-9,-3蛋白的活化情况；　　 11、ELISA阻断实验　　 (1)Caspase-8,-9抑制剂对黄芩素诱导的SCL-12细胞凋亡的影响；　　 (2)Fas中和抗体ZB4对黄芩素诱导的SCL-12细胞凋亡的影响。　　 结果　　 1、MTT法检测处理因素对细胞的增殖抑制作用　　 (1)黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均可以抑制SCL-1、SCL-12、SCL-13细胞增殖,呈明显的浓度与时间依赖性(P值均＜0.01)。其中,黄芩素对三株人皮肤鳞癌细胞(对SCL-12细胞生长抑制作用最强,对SCL-13细胞作用最弱,对SCL-1细胞作用介于二者之间;F=49.46,P＜0.01)生长抑制作用最强,黄芩苷抑制作用最弱,汉黄芩素抑制作用介于二者之间;差异具有统计学意义(P值均＜0.01)。　　 (2)黄芩素对HaCaT细胞生长也有抑制作用,但在相同作用时间下,明显弱于黄芩素对SCL-12细胞的增殖抑制作用,差异具有统计学意义(P值均＜0.001)。　　 (3)阿维A酸能抑制SCL-12细胞增殖,呈明显的浓度与时间依赖性(P值均＜0.01)。阿维A酸对HaCaT细胞也有生长抑制作用,但在相同作用时间下,明显弱于阿维A酸对SCL-12细胞的增殖抑制作用,差异具有统计学意义(P值均＜0.01)。　　 (4)黄芩素与阿维A酸联合应用可显著抑制SCL-12细胞增殖,与单独用药比较,差异具有统计学意义(P值均＜0.05)。　　 2、Annxin V和PI结合实验检测细胞早期凋亡　　 (1)Annxin V和PI结合实验显示,黄芩素能显著诱导SCL-12细胞凋亡,具有时间依赖性(P＜0.001)。黄芩素对HaCaT细胞也有凋亡诱导作用,但在相同作用时间下,明显弱于黄芩素对SCL-12细胞的凋亡诱导强度,差异具有统计学意义(P值均＜0.001)。　　 (2)Annxin V和PI结合实验显示,黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均能诱导SCL-12细胞凋亡,其中黄芩素凋亡诱导作用最强(P＜0.001)。　　 (3)Annxin V和PI结合实验显示,黄芩素、阿维A酸单独及联合应用均能诱导SCL-12细胞凋亡,联合用药组对SCL-12细胞凋亡的诱导作用显著高于单药作用组,差异有统计学意义(P值均＜0.05)。　　 3、Cell Death Detection ELISAkit检测细胞凋亡　　 (1)黄芩素能诱导SCL-12细胞凋亡,具有明显的量效和时效依赖性关系(P值均＜0.01)。　　 (2)药物浓度为12.5μmol/L的三种黄芩衍生物均能不同程度地诱导SCL-12细胞凋亡,具有时间依赖性(P值均＜0.01);其中黄芩素凋亡诱导作用最强(P值均＜0.05)。　　 (3)黄芩素和阿维A酸联合应用可显著诱导SCL-12细胞凋亡,与单药作用比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。　　 4、流式细胞仪检测细胞周期　　 (1)黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均能将SCL-12细胞周期阻滞于G1期,其中黄芩素作用最强。　　 (2)黄芩素、阿维A酸单独及联合应用均能将SCL-12细胞周期阻滞于G1期,其中联合用药组作用最强。　　 5、流式细胞仪检测黄芩素诱导SCL-12细胞膜表面分子Fas表达黄芩素作用于SCL-12细胞12h、24h、36h、48h后,细胞膜表面Fas抗原的阳性率逐渐升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.001)。　　 6、流式细胞仪检测黄芩素诱导前后SCL-12细胞线粒体膜电位的改变黄芩素作用于SCL-12细胞12h、24h、36h、48h后,细胞线粒体膜电位逐渐下降,呈现明显的时间依赖性(P＜0.001)。　　 7、凋亡的形态学改变　　 (1)荧光显微镜下观察,对照组SCL-12细胞胞核呈淡黄绿色、分布均匀、核形态规则,胞浆为橙红色;12.5μmol/L黄芩素作用48h后,细胞核形态明显不规则,胞核染色质呈黄绿色浓聚于核膜内侧,核固缩、碎裂,胞膜呈泡状膨出,可见凋亡小体。　　 (2)倒置相差显微镜下观察,对照组SCL-12细胞形态饱满、生长旺盛、贴壁良好;3.125μmol/L黄芩素作用48h后,细胞膜略皱缩、形态不规则;5.0μmol/L阿维A酸作用48h后,细胞体积缩小、胞膜明显皱缩、形态不规则;联合用药组的SCL-12细胞皱缩,贴壁不良,大多数细胞脱壁漂浮。　　 8、实时荧光定量RT-PCR实时荧光定量RT-PCR结果显示,黄芩素作用12h、24h、36h、48h后,SCL-12细胞Fas,FasL mRNA表达水平均显著上升,与0h组比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。　　 9、Western blot结果　　 (1)黄芩素作用SCL-12细胞12h后,能明显活化caspase-8及上调Fas、FasL、Fas相关死亡结构域(Fas-associated death domain,FADD)蛋白的表达,具有时间依赖性(P值均＜0.001)。黄芩素作用SCL-12细胞24h后,开始明显活化caspase-9,-3和easpase-3的底物多聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP),活化程度亦随着作用时间的延长而增强(P值均＜0.001)。　　 (2)黄芩素、阿维A酸单独及联合作用SCL-12细胞24h后,均能明显活化caspase-8,-9,-3蛋白;联合用药组蛋白的活化程度明显高于单独用药组(P值均＜0.05)。　　 10、ELISA阻断实验结果　　 (1)Caspase-8抑制剂能有效阻断黄芩素诱导的SCL-12细胞凋亡,而caspase-9抑制剂对黄芩素诱导的凋亡无明显影响。　　 (2)Fas中和抗体ZB4能显著阻断黄芩素诱导的SCL-12细胞凋亡。　　 结论：　　 1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均可以抑制体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-1、SCL-12、SCL-13细胞株增殖,且在一定范围内呈时间浓度依赖性;其中黄芩素生长抑制作用最强,SCL-12细胞对三种黄芩衍生物的增殖抑制作用最敏感。　　 2、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均可以诱导体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-12细胞株凋亡,其中黄芩素的凋亡诱导作用最强。　　 3、黄芩素诱导SCL-12细胞凋亡是通过Fas死亡受体和线粒体途径共同介导的,其中死亡受体途径发挥了主导作用。　　 4、黄芩素、阿维A酸联合应用可抑制SCL-12细胞增殖并诱导其凋亡,机制与细胞周期Gl期阻滞及活化caspase-8,-9,-3蛋白的表达有关。