草甘膦是世界销量最大的除草剂,其在橡胶园喷施除草会影响橡胶树生长,甚至会导致橡胶树死亡。但橡胶树草甘膦药害发生机制还不清楚。为了研究橡胶树对草甘膦药害生理和分子响应机制,本文采用植物生理学、分子生物学、生物信息学和转录组技术研究草甘膦对橡胶树药害的作用机制。采用植物生理学方法分析草甘膦对橡胶树叶片的生理指标变化的影响;采用RT-PCR技术克隆橡胶树HbEPSPS基因,用生物信息学分析橡胶树HbEPSPS结构,采用Q-RT-PCR技术系统地分析HbEPSPS在草甘膦、白粉菌、植物激素和胁迫处理后的表达模式;并对喷施草甘膦的橡胶树叶片进行转录组分析。结果如下:1、喷施170mg·L-1草甘膦导致橡胶树叶片脱落,引起新生叶片变长、畸形,下一蓬新生叶形状会部分恢复。草甘膦导致叶绿素含量下降,可溶性糖含量下降,脯氨酸含量升高,过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加,但含水量差异不显著。2、莽草酸积累量在草甘膦喷施橡胶树叶片前后呈显著差异,橡胶树叶片出现半黄半绿表型时莽草酸积累量上升,新生畸形叶和恢复叶中莽草酸含量下降。喷施草甘膦后各类型叶片生长素和赤霉素的含量均与未喷施前对照叶片差异不显著,脱落酸和玉米素含量较对照差异显著。半黄半绿叶片脱落酸和玉米素含量较未喷施对照分别下降,两种再生畸形叶出现后,脱落酸和玉米素含量较未喷施前对照分别升高。3、克隆橡胶树HbEPSPS基因cDNA序列全长1891bp,包含一个 1572 bp的开放阅读框,编码523个氨基酸,含有特征性EPSPS家族结构域,不含跨膜结构和信号肽。系统进化树分析表明,橡胶树EPSPS蛋白质序列与麻风树的EPSPS同源性较高。根据荧光定量PCR分析显示,HbEPSPS基因在花中的表达量最高,其次是树皮和叶,在胶乳中表达量最低。草甘膦作用下,叶片处于半黄半绿时HbEPSPS的表达量显著提高,当橡胶树落叶长出新畸形叶和恢复叶时,其表达与对照无显著差异。白粉菌和机械伤害能够显著诱导HbEPSPS下调。干旱、激素和H2O2处理诱导HbEPSPS上调。4、利用Illumina Hiseq 4000测序平台对喷施草甘膦0d、1d、2d和3d的橡胶树叶片进行转录组测序。共产生18 Gb的数据,数据经过滤后,共获得83,486个 All-Unigenes。将 All-unigenes 分别与 NR、NT、GO、COG、KEGG 和 Interpro数据库进行注释和比对,预测59,608个CDS,预测转录因子编码基因2,389个,预测SSR标记位点9,846个和SNP位点。三组样品1d比0d、2d比d和3d比0d分别筛选出16,342、19,100和20,613个差异表达基因。将差异表达基因进行聚类、GO注释和代谢通路分析发现,这些差异表达基因响应草甘膦在橡胶树中的代谢途径。筛选46个响应草甘膦的差异表达基因,这些基因都与蛋白合成、色素以及转录调控因子有关,还发现一些未知功能基因。采用Q-RT-PCR技术对转录组数据结果进行验证,规律一致。根据以上结果得出以下结论:1、草甘膦药害导致橡胶树叶片畸形,叶绿体结构变化,使光合作用受抑制,影响光合作用、活性氧代谢和渗透调节物质等生理过程。2、草甘膦药害导致橡胶树叶片莽草酸途径受阻,引起脱落酸和玉米素含量变化。3、HbEPSPS与草甘膦、激素、干旱、白粉菌和机械伤害等逆境胁迫反应相关。4、转录组数据筛选出橡胶树草甘膦相关调控基因,这些基因与蛋白合成、色素以及转录调控因子有关。本研究为阐明橡胶树草甘膦的药害机制和抗草甘膦橡胶树分子标记辅助育种提供理论基础。