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通过对本实验室保藏的交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)JM6、JM8、JM14、JM30和JM310菌株进行活化、摇瓶发酵和传代稳定性试验,确定遗传性能较为稳定的JM8(9.3μg/mL)为诱变育种的出发菌株。
对JM8菌株进行氯化锂-紫外线诱变育种,结合链霉素抗性平板筛选,获得比出发菌株JM8效价分别提高9.32倍和6.34倍的菌株UV90(96.0μg/mL)和UV50(68.3μg/mL),对UV90进行60Co-γ射线辐射诱变,所得诱变菌株效价不高且易发生回复突变,未能筛选到高产菌株。对氯化锂-紫外线诱变获得的另一高产菌株UV50(68.3μg/mL)进行分离复壮,获得一株效价较高、遗传性能较为稳定的菌株UV50-20(70.7μg/mL)。以UV50-20为出发菌株,探索菌龄和溶菌酶浓度、酶解时间及酶解温度对原生质体形成和再生的影响,确定制备原生质体的适宜条件为:选用种子液中培养34小时的菌丝体,在4mg/mL的溶菌酶浓度下,于32℃水浴中酶解90min。对菌株UV50-20进行了原生质体再生筛选,获得了遗传性能较为稳定的菌株Y19(0μg/mL)和效价比UV50-20提高1.22倍的菌株Y13(157.3μg/mL);对Y13进行原生质体-紫外线诱变,得到比Y13效价提高15.89%的菌株YU15(182.3μg/mL)。通过紫外灭活YU15原生质体,并与Y19原生质体融合筛选得到一株比亲本菌株效价提高17.72%的融合子R29菌株(214.6μg/mL)。传代试验表明菌株JM8、UV50、UV50-20、Y19、Y13、YU15和R29传代均比较稳定。
利用SAS软件以菌株R29为试验菌株进行了发酵培养基配方的优化研究。首先,采用Plackett-Burman设计法法筛选出影响R29发酵合成交沙霉素的主要因素为棉籽饼粉和豆油,继而利用最陡爬坡路径试验找到试验中心点,综合中心组合设计和响应面分析法确定主要因素的最佳浓度。试验发现采用1.9%棉籽饼粉和0.41%豆油,交沙霉素生物发酵效价达到最大值550μg/mL,比优化前的原始配方提高10.66%。
另外,对菌株JM8和菌株R29发酵过程中的菌丝湿重、滤速、糖含量、铵离子含量及效价进行了测定,为交沙霉素工业发酵提供参考指标。