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利用无标记基因操作方法进行遗传操作，可以实现筛选标记的回收和重复使用，便于对同一宿主进行多次遗传改造。为了在毕赤酵母（PichiaPastoris）中高效合成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM），本课题在本实验室前期所构建SAM高产菌DS16（过表达高活性的重组SAM合成酶）的基础上，建立无标记基因操作方法，并利用此方法进一步优化重组毕赤酵母中的SAM合成。 以博来霉素抗性(Zeocinresistance，ZeoR)和毒蛋白MazF分别作为正向和反向筛选标记，构建无标记基因操作单元CYCTT-MazF-ZeoR-CYCTT。含有此单元的载体通过两侧同源序列定点整合到P.Pastoris染色体上，反向筛选标记MazF在AOX启动子调控下，受甲醇诱导表达可抑制细胞生长。经传代和甲醇筛选后，可实现两侧正向重复序列CYCTT之间发生同源重组，获得无标记基因的重组菌，有效回收筛选标记。 以DS16为出发菌，利用强度较弱的启动子G12替换SAM转化代谢途径中的β-胱硫醚合成酶（Cystathionine-β-synthase，CBS）基因cys4启动子，弱化CBS表达，得到重组菌G/CG。与DS16相比，在摇瓶发酵过程中，G/CG的生长和SAM合成酶活性未受影响，SAM产量提高54％。 敲除DS16中SAM另一转化途径中的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2，并在其位点插入能促进氧传递和ATP合成的透明颤菌血红蛋白基因vgb，得到分别由甲醇诱导型启动子AOX1和低氧诱导型启动子PsADH2调控vgb表达的重组菌DS16/DsvA和DS16/DsvP。摇瓶培养的结果表明，spe2基因的敲除未造成重组菌营养缺陷。与出发菌相比，DS16/DsvP和DS16/DsvA的细胞干重分别提高11.8％和23.1％，单位菌体SAM产量分别提高17.7％和37.3％。