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肺移植是终末期肺病唯一有效的治疗措施,但供体肺来源的缺乏严重制约着临床肺移植开展,利用组织工程技术构建人工肺脏可能成为解决上述问题的可行方法。脱细胞肺支架(DCLS)是组织工程肺理想的支架来源。肺脏具有结构疏松、拥有气道和血管两套管路系统等特点,采用什么样的脱细胞方法才能获得理想的效果,一直是肺脏器官工程的重要研究课题。目前报道的制备器官脱细胞支架的方案有多种。DCLS制备常采用去垢剂为主的方案,如十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)等。以两性离子洗涤剂为代表的试剂CHAPS脱细胞效果佳,且能完整保存胶原质、保持细胞基质的性能,但其易使胶原纤维变形,对糖胺聚糖(GAG)的保存效果较差。作为一种离子型去细胞剂的SDS能增进细胞膜和核膜的溶解,可致蛋白变性。可从致密组织上有效去除核物质和胞质蛋白,可致超微结构破坏,去除糖胺聚糖和生长因子,损伤胶原。作为螯合剂代表的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)可使细胞和细胞外基质(ECM)之间的连接破坏,但其通常与酶制剂联合使用也可与其他制剂联合使用,单独使用时效果较差。冻/融法为一种物理去细胞方法,可有效溶解组织或器官细胞,但是细胞膜和细胞内容物仍然存在,不会引起ECM蛋白松散。本实验首先比较了采用含有去垢剂的实验组灌洗的肺组织同不含有去垢剂的对照组灌洗的肺组织HE染色,再采用SDS、CHAPS、EDTA-2Na、冻/融+SDS四种方法制备脱细胞肺支架DCLS,比较了不同方法的脱细胞效果和所制备DCLS细胞外基质保留的完整性,最后进一步比较了不同试剂浓度对SDS和CHAPS脱细胞效果的影响,以确定最佳的脱细胞方案。[目的]1、比较用实验组(含有去垢剂)及对照组(不含去垢剂)分别灌洗肺组织的HE染色。2、比较SDS、CHAPS、EDTA-2Na、冻/融+SDS四种制备DCLS方法的脱细胞效果和所制备DCLS的完整性。3、比较试剂浓度对SDS和CHAPS脱细胞效果的影响。[方法]1、分别用实验组试剂及对照组试剂灌洗肺组织,将灌洗后的肺组织进行HE染色对比。2、分别配制不同浓度的SDS、CHAPS、EDTA-2Na灌流液体,采用灌流法制备DCLS,对脱细胞后的肺组织进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色、弹性纤维(EVG)染色和胶原纤维(COL-1、COL-3)免疫组化染色,通过对比各种染色结果得出哪种方法灌洗肺组织效果最好。3、分别用三种不同浓度的SDS(0.1%SDS、0.2%SDS、0.3%SDS)及三种不同浓度的CHAPS(4 mmol/LCHAPS、8 mmol/LCHAPS、12 mmol/LCHAPS)灌洗脱肺组织,通过对比灌洗后肺组织的胶原质3及纤维连接蛋白免疫荧光染色及检测各组脱细胞后肺组织残留核酸(DNA)含量选出优化的浓度及试剂制备脱细胞肺支架。[结果]1、对照组灌洗的脱细胞肺组织HE染色和实验组HE染色脱细胞后肺支架保存均较完整,而实验组细胞脱落几乎全无,对照组细胞结构保存较完整。2、SDS、CHAPS、EDTA-2Na、冻/融+SDS四种方法都可以达到较好的脱细胞效果;综合HE染色、Masson染色、免疫组化染色和EVG染色结果表明:采用CHAPS灌流制备的脱细胞支架结构最完整,保留支架中胶原纤维、弹性纤维效果最好,且能有效的去除核酸。3、免疫荧光染色对比及脱细胞肺组织中核酸残留量结果表明4mmol/L CHAPS组为优化的脱细胞肺组织组。[结论]在我们现有实验条件下,4mmol/LCHAPS灌流法制备脱细胞肺支架是最优方案。