调控小麦种子休眠的关键基因鉴定与调控网络构建

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:bobby_hong
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种子休眠是植物在长期系统发育进程中获得的一种适应环境变化的特性,这种特性能够确保种子在逆境中存活,防止种子在不适宜的季节萌发。同时,种子的休眠特性和环境温度分别被认为是影响穗发芽抗性的主要内在和外在因素。本研究以强休眠品种SN5058为研究对象,利用转录组测序技术获得了其休眠种子在常温和低温两种处理的种子萌发表达谱。通过生物信息学分析及分子试验鉴定到低温打破种子休眠的关键基因,构建了低温和常温下种子休眠的调控网络,为禾谷类作物种子休眠和萌发的调控机理研究及小麦抗穗发芽育种提供重要支撑,主要结果如下:(1)通过对205份不同休眠水平的材料在低温(5℃)和常温(25℃)下7天的发芽率进行鉴定,共筛选到典型的低温敏感型(SN5058和SN5059)和低温不敏感型(SN4701和SN5133)材料各2份。其中低温敏感型材料SN5058在低温处理后发芽率接近100%,而常温下发芽率接近于0%。以低温敏感型材料SN5058为研究对象,分别对休眠种子的低温和常温处理下萌发籽粒的胚进行RNA-seq,获得小麦籽粒萌发阶段的表达谱。(2)通过分析SN5058的转录组数据,确定该组数据能够对小麦低温打破休眠过程中的转录组足够覆盖,确定了低温处理6小时便可打破休眠,通过q RT-PCR验证得知转录组数据中的基因表达量可信度高。利用WGCNA分析共获得21个基因共表达模块,其中红色模块与低温打破休眠呈显著正相关。通过可视化软件Cytoscape鉴定到红色模块中调控低温打破休眠的关键基因Traes CS6D01G357700,并将其命名为Ta SPT。(3)利用亚细胞定位试验和酵母反式自激活试验证明Ta SPT不具有转录激活活性。结合RNA-seq数据和低温不敏感型材料中Ta SPT基因的表达,得知该基因是通过在低温处理初期的上调表达来影响种子的休眠状态。利用酵母双杂交系统筛选并验证到了与Ta SPT存在互作关系的蛋白,并将该互作蛋白对应的基因命名为Ta UEV。分析得知该蛋白为泛素结合酶,这表明Ta SPT可能通过蛋白质的泛素化途径来调控种子休眠。此外,利用CRISPR/Cas9技术对Ta SPT进行了基因编辑,目前已获得具有稳定遗传的纯合阳性植株,正在进行功能验证。(4)通过WGCNA分析构建了调控种子休眠主效基因TaPHS1的调控网络,并分别鉴定到7个调控TaPHS1的基因和14个受TaPHS1调控的基因。通过对基因Novel12181分析发现该基因为b HLH家族的一个转录因子,克隆并分析发现该基因编码一个303AA的ALC蛋白,将该基因命名为Ta ALC。结合调控网络和表达数据得知,该基因可能通过正向调控TaPHS1进而调控种子休眠。另外,还利用酵母双杂交系统对TaPHS1蛋白的互作蛋白进行了筛选,筛选到3个与TaPHS1存在互作关系的蛋白,它们分别是蛋白激酶(TaPK)、电压依赖性阴离子通道蛋白(Ta VDAC)和木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶(Ta XTH)。(5)利用亚细胞定位试验对TaPHS1、TaPK和Ta VDAC蛋白进行了定位,结果表明它们分别被定为在细胞核和细胞质、细胞膜、线粒体,而Ta XTH蛋白未显示定位结果,但网站预测该蛋白可能在胞外发挥功能。通过对3个基因的基因功能注释和亚细胞定位试验得知,它们可能分别在种子休眠调控中的信号传导、能量供应及胚乳弱化方面发挥着重要的功能。
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