抑癌蛋白P53是目前已知与人类肿瘤发生发展最为密切相关的分子之一,也是控制细胞增殖、凋亡的蛋白网络的节点分子。p53作为重要的一种转录因子,在感应不同类型的细胞应激时,如DNA损伤、细胞异常增殖和原癌基因激活等,其活性迅速增强,并选择性调控其下游与细胞周期阻滞、细胞凋亡或DNA损伤修复相关的靶基因的表达,从而诱导细胞周期阻滞和/或细胞凋亡的发生。近年来,p53的选择性调控方面越来越受关注,如对Hzf、hCAS/CSE1L、TP53INP1和ASPP家族成员等多种p53选择性调控分子进行了鉴定和功能研究,这对阐明p53在维持细胞的正常生长和防止癌变等方面的精确调节作用有着重要的意义。含有KRAB(Kruppel-associated box)结构域的锌指蛋白(KZNF)是人类基因组中最大的转录调控因子家族,KZNF通过与其转录抑制辅因子KAP-1(KRAB box-associated protein-1)及其它转录因子结合,发挥特异的转录抑制功能。本实验室的前期研究鉴定了一种p53负调控分子Apak明确了其选择性下调p53凋亡相关的靶基因表达的调控机制。Apak(ATM and p53 associated KZNF protein)是KZNF家族中的一员,它能够选择性下调凋亡相关的p53靶基因表达,抑制p53介导的细胞凋亡,而对细胞周期阻滞、细胞新陈代谢等及其它p53参与的生理功能没有调控作用。前期结果揭示了KZNF家族成员Apak在p53选择性调控中有着重要的作用。KZNF家族成员的数量多达400多个,是仅存于四足脊椎动物中的一个转录调控因子家族,其家族成员的结构特征是N端含有保守的KRAB结构域,中部及C端含有数目不等的C2H2型锌指结构,KZNF的KRAB结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用,具有较强的转录抑制功能。根据KRAB的类型不同,可将所筛到的KZNF家族成员分为七类,分别为KRAB-A,KRAB-AB,KRAB-AC,KRAB-SAB,KRAB-ABL,KRAB-SA,KRAB-S,其中,KRAB-A,KRAB-AB,KRAB-SAB成员较多。我们感兴趣的是,除了Apak外,KZNF家族中还有多少成员可具有类似Apak的角色,参与p53的调控,各成员间的协同关系又是怎样的,这些也正是本课题拟探讨的科学问题。本论文立足于前期研究的基础上,首先继续完成筛选出的含有ATM底物磷酸化位点SQ/TQ模序的48个成员质粒的构建,并进而成功构建了其中的7个分子的真核细胞表达质粒,目前在前期准备的基础上,除了ABxZ型外,含有AxZ型、SABZ型和ACxZ型的KZNFs需构建的质粒共有17个;然后利用报告基因活性分析体系检测了构建成功的16个KZNFs分子对p53转录活性的调控,筛选出7个成员(即ZNF205、ZNF475、ZNF420、ZNF589、ZNF498、ZNF417、ZNF202)对p53的转录因子活性具有较强的下调作用。有趣的是,还发现一个成员ZNF136对p53的转录因子活性具有较强的上调功能,我们接着通过western blot的方法检测KZNFs分子对p53及其下游靶基因的蛋白表达水平的影响,初步探讨了p53选择性调控的方向。在检测的4个分子中,ZNF205、ZNF597能选择性下调p53介导的细胞凋亡靶基因的蛋白水平;而ZNF475、ZNF498能选择性下调p53介导的细胞代谢靶基因的蛋白水平。此外,确定了能显著抑制p53转录活性的KZNFs与p53的结合关系,结果表明,在检测的5个成员中4个均可以和p53相互作用。综上所述,本论文在前期研究基础上,进一步研究了KZNF家族在重要抑癌蛋白P53复杂调控网络中的可能作用,序列分析搜索到了全部48个作为候选ATM底物的KZNF成员,成功克隆了17个KZNFs分子中(除了ABxZ型外)的16个成员,筛选出多个对p53活性具有抑制功能的分子,从而进一步证实KZNF家族确实存在更多的p53调控蛋白。本研究对加深认识和理解KZNF家族的生理功能具有潜在的原创性价值,有助于解释p53调控的时空复杂性,并为靶向p53及其调控分子的肿瘤治疗提供了更多的科学线索。