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人参(Panax ginseng C.A.Meyer)属珍贵的多年生草本药用植物,在中国东北栽培历史悠久,具有重要的经济和药用价值。人参菌核病是由人参核盘菌(Sclerotinia ginseng Wang et Chen)引起的一种主要的根部病害,严重影响人参的产量和质量,导致重大经济损失。分泌液(exudate)是产核真菌在菌核发育过程中产生的一种重要代谢产物,与菌核的发育和致病密切相关。本文采用植物病理学和分子生物学研究方法对人参核盘菌分泌液的生物学特性、代谢成分、蛋白组分、致病作用及影响土壤微生物群落结构作用进行了系统的研究,旨在揭示人参菌核分泌液在菌核生长发育和致病过程中的作用,研究结果如下。1.系统研究了人参核盘菌分泌液的致病机制。人参核盘菌分泌液中含有多聚半乳糖醛酸酶(PG)和羧甲基纤维素酶(Cx)。与菌丝中鉴定出的细胞壁降解酶比较,分泌液中的PG酶活性显著高于菌丝中的PG酶活性,Cx酶活性较菌丝中低。分泌液接种人参根部可以形成侵染病斑,对参根组织产生分解作用,同时可诱导人参根部多种防御酶系(PAL,POD,CAT,SOD,PPO)的上升。研究观察发现,相较菌丝侵染参根,分泌液具有侵染快速,致病力强,病程持续时间短,病斑扩散速度慢等特点。2.对人参核盘菌分泌液的生物学特性进行了系统研究。通过生物学特性研究表明,PDA为供试菌株产生分泌液的最适培养基,适宜菌丝生长的碳源为蔗糖,最适宜分泌液产生的碳源是葡萄糖。蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉这三种有机氮能显著的促进菌丝的生长。当以酵母浸粉为氮源时,人参核盘菌产核数量最多,显著高于其他氮源。并且在酵母培养基中菌核的鲜重、干重和产分泌液总量均显著高于其他氮源。当葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉浓度在60 g/L时出现最快生长速率,但相同浓度下,葡萄糖更有利于菌丝的生长。当碳源为葡萄糖且浓度为30 g/L时,分泌液形成量最多。1.5 g/L酵母浸粉浓度下菌丝生长速率显著高于其他条件。酵母浸粉在浓度范围为2.0~3.0 g/L时,分泌液生成量显著高于其他浓度。高浓度的酵母浸粉有助于菌核的形成,但却会抑制分泌液的产生。供试菌株在酵母浸粉浓度为3 g/L,蔗糖浓度为30 g/L时的菌丝生长速率最快,并且分泌液产量显著高于其他处理组。供试菌株的菌丝生长、菌核及分泌液的生成的最适pH为5。3.首次证明人参核盘菌分泌液具有影响土壤微生物群落结构的作用。与空白对照相比,不同浓度的分泌液对人参核盘菌的生长均起到促进作用,浓度为4%时菌丝生长速率明显加快。通过比较不同处理条件下对人参根际土壤微生物群落结构的影响,在对细菌的UPGMA分类树分析发现分泌液处理组与菌悬液处理组可使土壤中的细菌群落结构向更为相似的组成发展,而通过对真菌的UPGMA分类树分析发现分泌液处理组与分泌液+菌悬液处理组可产生较为相似的土壤真菌群落结构。并且从真菌UPGMA分类树还可以观察到分泌液处理组,菌悬液处理组和分泌液+菌悬液处理组的真菌群落中子囊菌门真菌丰度较高,说明分泌液和菌悬液在影响土壤真菌群落组成及丰富度上有一定程度的相似作用。4.首次对人参核盘菌分泌液的成分进行鉴定。利用火焰原子吸收光谱法(FAAS),纳氏试剂分光光度法,高效液相色谱法(HPLC)以及气相色谱-质谱联用(GC-MS),明确人参核盘菌分泌液中含有K,Na和Mg离子、游离氨、草酸、咖啡酸、阿魏酸、没食子酸、单宁酸、香草酸、肌醇、葡萄糖和海藻糖。通过鉴定出的分泌液成分可以进一步推测分泌液在致病和影响土壤微生物群落结构上起到一定程度的作用。5.利用转录组学,首次提供高质量的人参核盘菌转录组数据,并对人参核盘菌和核盘菌进行了比较分析。从样品中组装出14,904个独立基因(unigenes),有12,424个独立基因被注释。通过GO功能分析,发现在3个组别中富集最多的亚组有细胞进程,代谢进程,细胞,细胞部分,催化活性和转运活性。将核盘菌与人参核盘菌进行比较,发现有17,638个同源基因,证明两种病原菌具有较高的亲缘性。对组装的pg1,pg3,pg5和pg6基因进行进化分析,发现pg1,pg3和pg6均与核盘菌属真菌分到一起,pg5与小核菌属中的Sclerotium cepivorum分到了一起。4个pg基因明显的分到不同的4个类群中,可以证明每个基因在进化方面都是相对独立的。对鉴定出了两个pac1同源基因进行遗传进化分析,发现人参核盘菌的pac1同源基因与Sclerotinia sclerotiorum,S.cepivorum和Dumontinia tuberosa分到一起。这可以说明pac1基因在所选取的分类样本中具有高度的保守性。6.首次利用蛋白组学技术对人参核盘菌分泌液的蛋白组分进行分析。通过蛋白组学技术鉴定出人参核盘菌分泌液中的59个非冗余蛋白质。通过生物信息学分析将鉴定出的蛋白归为6类,分别是碳水化合物代谢组(39%),氧化还原进程组(12%),转运和分解代谢组(5%),氨基酸代谢组(3%),其他功能组(18%)和未知功能蛋白组(23%)。在碳水化合物代谢组中,有许多蛋白参与到真菌细胞壁的重塑和修饰,部分蛋白与病原菌的致病性相关。未知功能功能蛋白组中有一类蛋白是在菌核发育过程中特异性表达的蛋白(Ssp1)。氧化还原进程组中的许多蛋白与真菌黑色素形成有关。