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第一部分：Sil1及其片段在毒胡萝卜素诱导的细胞凋亡中的作用 研究背景:内质网(ER)应激及ER相关分子伴侣参与了多种神经退行性疾病的发病过程。作为ER功能的重要调节因子及分子量为78 kDa的葡萄糖调节蛋白(78-kDa glucose-regulated protein,GRP78)的共同分子伴侣,Sil1的突变会引起神经退行性疾病—Marinesco-Sj(o)gren综合征(MSS)的发生、小鼠小脑浦肯野细胞退化并表现出共济失调;Sil1的缺失会引起GRP78的ATP循环出现异常、蛋白质发生聚集。本课题组前期研究也发现:ER应激诱导剂引起GRP78水平升高的同时,Sil1水平却下降;过表达Sil1能逆转GRP78水平升高引起的微管相关蛋白tau蛋白的过度磷酸化。这些研究说明Sil1功能异常是中枢神经元退行性变性中的重要环节,调节Sil1可能改变神经元退行性变性的进程。 目的:进一步研究Sil1在内质网应激诱导的凋亡中的作用。 方法:通过western blotting技术检测Sil1在不同月龄的Tg2576小鼠和C57小鼠海马中的表达情况。通过构建Sil1表达载体和si-RNA技术,上调或降低HEK293细胞中Sil1表达水平,给予0.5μM的内质网凋亡诱导剂毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)处理12小时,运用CCK8试验检测细胞活力的变化,通过western blotting技术检测内质网应激诱导的凋亡通路中信号分子的变化;将表达Sil1蛋白特定片段的质粒转入HEK293细胞,给予同样的TG处理,检测细胞活力和凋亡分子的变化情况,探索Sil1抗内质网应激诱导凋亡的关键序列。 结果: (1)AD模型小鼠(Tg2576)脑部海马组织中Sil1水平低于同龄C57小鼠,且两种小鼠海马中Sil1的表达水平都随着年龄的增长而下降; (2)上调Sil1的表达水平可以抑制HEK293细胞中TG诱导的细胞凋亡,而下调Sil1的表达水平会增强TG诱导的细胞凋亡; (3)将特定表达Sil1上1-250、250-460和113-421段氨基酸的真核表达载体转入细胞内,观察到Sil1的250-460片段和113-421片段也具有抗凋亡作用; (4)下调原代海马神经元细胞中Sil1的表达水平后其轴突生长明显受到抑制。 结论:Sil1能够保护HEK293细胞对抗毒胡萝卜素诱导的凋亡。 第二部分两种吴茱萸提取物降低WT/GFX诱导的tau过度磷酸化 研究背景:阿尔兹海默症(Alzheimers disease,AD)是目前老年人群发病率较高的一种神经退行性疾病。现在依然没有一种完全有效的药物可以治疗AD病人。之前所开发出的药物,只能暂时改善病人的认知障碍,不能从根本上改善和根治疾病。我们前期发现,去氢吴茱萸碱(Dehydroevodiamine,DHED)可以减弱由花萼海绵体诱癌素A(Calyculin A,CA)所诱导的tau的过度磷酸化。同样,在老鼠模型中,DHED可以通过降低GSK-3β的活性来减弱Wortmannin(WT)和GF-109203X(GFX)诱导的tau的磷酸化水平,并改善大鼠空间学习记忆能力。这显示,DHED在tau蛋白过度磷酸化过程中发挥保护作用。本实验中,我们从葛兰素史克公司获得了2种从吴茱萸中提取的去氢吴茱萸碱类似物,010和007,验证这两种化合物对tau磷酸化的影响,对寻找新的治疗AD的有效药物具有重要意义。 目的:探讨2种吴茱萸提取物对N2awt细胞中WT/GFX诱导的tau磷酸化的影响。 方法:用1μM的WT/GFX处理N2awt细胞不同时间,通过western blotting方法检测tau蛋白磷酸化水平以选择最佳的处理时间;使用CCK8试剂盒检测提取物010和007对细胞活性的影响;最后通过western blotting检测在不影响细胞活性的情况下,010和007对WT/GFX诱导的tau磷酸化的影响。 结果: (1)使用1μM的WT/GFX处理N2awt细胞6小时时,tau磷酸化水平最高; (2)使用浓度小于等于250μM的吴茱萸提取物010和浓度小于200μM的007处理N2awt细胞1小时,不会对细胞活性产生影响; (3)采用不同浓度的010预处理N2awt细胞1小时,可以降低由WT/GFX所诱导的Ser404、Ser396和Thr231位点tau蛋白的磷酸化; (4)采用不同浓度的成分007预处理细胞1小时,可以降低WT/GFX诱导的tau蛋白磷酸化。 结论:吴茱萸提取物010和007可以明显降低N2awt细胞中由WT/GFX诱导的tau的磷酸化水平,并且其保护作用比DHED更加明显。 第三部：分利用FRAP技术研究GSK-3和tau对ChAT运输的影响 研究背景:乙酰胆碱转移酶(ChAT)是合成乙酰胆碱的关键酶,其表达水平和转运过程会直接影响乙酰胆碱(ACh)的水平。严重的阿尔兹海默症(Alzheimers disease,AD)患者脑中新皮质区的ChAT活性明显下降。研究指出糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的激活与AD病人脑中胆碱功能的障碍有关。我们建立了GSK-3激活的动物模型,发现 GSK的激活会导致SD大鼠中Meynert基底核区ChAT水平降低,并且发现ChAT会在神经元胞体中聚集,提示我们GSK-3β的激活不仅降低ChAT的表达水平,可能还会抑制ChAT在轴突的表达或轴突运输。AD中另一种重要的蛋白质 tau,它的磷酸化会引起微管结构瓦解和破坏进而影响轴突转运功能。tau在蛋白质运输到轴突质膜的过程中可能起到轴突定位信号的作用。AD病人脑部tau的沉积和磷酸化可能也影响ChAT的轴突运输,导致ACh合成减少。本文中,我们运用荧光漂白后恢复技术(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)进一步证明了GSK-3β的激活和tau与ChAT运输障碍之间的关系。 目的:探索GSK-3β的激活和tau蛋白对ChAT的运输过程的影响。 方法:构建带有绿色荧光蛋白和鼠源型ChAT(RChAT)的表达载体,即pEGFP-C2-RChAT质粒。将质粒转入N2awt细胞中,36-48小时后给予WT/GFX(1μM)处理1小时,通过FRAP实验观察RChAT的输运情况。同样将pEGFP-C2-RChAT质粒转入HEK293wt细胞和HEK293tau细胞,36-48小时后安置在双光子激光扫描共聚焦显微镜上进行FRAP实验。 结果: (1)通过WT/GFX处理激活GSK活性后发现,RChAT在N2awt细胞突起中的运输受到明显的抑制,给予GSK抑制剂SB后可以改善这种情况,但无法完全消除; (2)tau蛋白的过度表达和磷酸化可以明显减弱RChAT在HEK293细胞突起中的运输。 结论:GSK-3的激活和tau蛋白过表达及磷酸化都可以抑制ChAT的运输过程。