论文部分内容阅读
背景随着纳米技术的飞速发展,纳米材料在肿瘤诊断和治疗的研究中备受瞩目。普鲁兰多糖因其良好生物相容性,常用作纳米药物输送载体材料。与正常细胞相比,生物素对于肿瘤的增殖必不可少且生物素受体在肿瘤细胞表面高度过表达,可以作为配体与纳米药物偶联达到主动靶向肿瘤的作用。根据课题组前期研制的乙酰普鲁兰多糖纳米药物载体的基础上,我们合成了生物素乙酰普鲁兰多糖(BiotinConjugated Pullulan Acetate,Bio-PA),并制备生物素化乙酰普鲁兰多糖纳米粒(Bio-PA NPs),考察其作为靶向抗肿瘤药物载体的可行性。目的1.探索并制备的Bio-PA NPs作为抗肿瘤药物载体的可行性;2.阐明Bio-PA NPs作为靶向抗肿瘤药物载体的体内外作用机制;3.探索体外三维肝肿瘤细胞培养及建立体内皮下移植瘤模型的方法,评价三维培养模型的优势,用于评价Bio-PA NPs体内抑瘤效应。方法1.纳米粒的制备及理化性质表征。合成PA及Bio-PA,并通过核磁共振谱仪对其结构进行表征。使用透析法以及溶剂挥发法制备空白及载药纳米粒,通过粒径分析仪测量纳米粒的粒径及其表面电势,透射电镜TEM观察纳米粒的形态,通过高效液相色谱测定载药纳米粒的载药量及药物的体外释放量,并通过生物素定量测定试剂盒测定纳米粒表面生物素的取代度及含量。2.纳米粒的体外细胞毒实验。选择生物素受体高表达的人乳腺癌MCF-7细胞和人肝癌HepG2细胞,生物素受体低表达的人肾上皮293T细胞三种细胞,通过CCK-8评价游离药物EPI、空白纳米粒和载药纳米粒对细胞增殖的影响,通过激光共聚焦及流式细胞分析仪对细胞摄取纳米粒情况进行定性、定量分析。3.向三种细胞加入特异性细胞吞噬抑制剂网格蛋白通道抑制剂氯丙嗪(CPZ)、溶酶体抑制剂氯喹(CQ)、巨胞饮抑制剂阿米洛利(AMR)、小窝蛋白介导的内吞抑制剂制霉素(NYS)、小窝蛋白介导的与胆固醇结合的摄取途径抑制剂菲律宾菌素(FLP)和生物素(Biotin),通过流式细胞分析仪及荧光发光仪检测荧光强度,对其摄取量进行定性及定量分析,并对细胞摄取纳米粒的途径进行探讨。4.观察比较二维及三维细胞培养模式下HepG2细胞形态学特征,通过向KM小鼠皮下注射二维及三维水凝胶的HepG2细胞,定期对其肿瘤大小及KM小鼠体重进行测量,来观察两种方式的成瘤情况,并对体重进行测定,通过组织切片对两种模式所形成的肿瘤组织的形态进行观察。5.纳米粒体内分布及抑瘤实验。用Cy7标记空白纳米粒,通过光声成像仪考察纳米粒进入荷瘤裸鼠体内的药物分布情况及其代谢情况;通过尾静脉注射观察荷瘤裸鼠肿瘤体积大小的变化来衡量其体内抑瘤效应。结果1.核磁图谱表明我们成功合成了PA和Bio-PA。透射电镜显示两种方法制备的纳米粒均呈均匀的球形,无黏连。但与溶剂挥发法相比,透析法制备的纳米粒无论是载药量、包封率还是生物素的取代度、生物素含量均比较高,且粒径均一,故后期选择透析法制备纳米粒。体外释放实验表明载药纳米粒在pH5.5的PBS溶液中释放的速度较pH 7.4的快,且前12 h释放较快,后缓慢释放。2.体外细胞毒实验表明浓度范围为5-1000μg/mL的两种空白纳米粒与三种细胞共孵育24 h和48 h,对细胞的增殖没有显著影响。载药纳米粒和游离药物EPI分别以0.025、0.25、2.5、10和25μg/mL与三种细胞共孵育24 h和48 h后发现BioPA/EPI NPs和PA/EPI NPs对细胞具有显著的细胞毒性且Bio-PA/EPI NPs效果最佳,说明其具有良好的体外抑瘤效果。细胞摄取途径研究表明网格蛋白介导的内吞途径是细胞摄取纳米粒的主要途径,加入游离生物素后,MCF-7和HepG2细胞对纳米粒的摄取减少为62.4%和60.5%,而293T细胞没有显著变化。3.通过显微镜图及激光共聚焦图的结果表明,HepG2细胞在三维水凝胶中呈球形生长且能形成细胞团,增加细胞之间的相互联系。动物成瘤实验表明三维模式下成瘤速度约为二维细胞模式下的2倍,体重变化比较稳定且没有出现动物死亡情况。4.以Cy7为对照,尾静脉注射Cy7-PA和Cy7-Bio-PA,用光声成像仪观察肿瘤部位发现12h后游离Cy7荧光消失,Cy7-PA和Cy7-Bio-PA直到24 h仍有荧光,且Cy7-Bio-PA显著强于Cy7-PA,说明纳米粒具有靶向性和长循环性。体内抑瘤实验结果显示,Bio-PA/EPI NPs显著抑制肿瘤生长,并且平均肿瘤体积显著小于对照组、PA/EPI NPs治疗组和EPI组。结论1.成功合成Bio-PA并制备了Bio-PA NPs,纳米粒粒径均一,形态圆整,具有较高的包封率和载药量,EPI的体外释放具有缓释性。2.空载纳米粒在一定浓度范围内无明显细胞毒性,Bio-PA/EPI NPs与PA/EPI NPs和EPI相比,生物素高表达的细胞摄取量增加且体外抑瘤效果显著增强。3.3D水凝胶培养易于形成细胞团,缩短建立体内皮下移植瘤模型时间,可以用于动物皮下移植瘤模型的建立。体内抑瘤实验表明Bio-PA NPs具有优良的肿瘤组织靶向性和抑瘤效应。4.综上所述,Bio-PA NPs在体内与体外均表现出良好的药物缓释性、长循环性和肿瘤靶向性,具有良好的开发应用前景,有望成为一种新的药物输送体系。