第一部分GEO数据库分析AMD患者与正常人眼组织中HGF的含量及功能预测目的:通过GEO数据库对比分析AMD患者和正常人眼组织HGF、VEGF的表达差异,并通过KEGG数据库对AMD患者中表达增强的基因集进行相互作用分析,得到可能与AMD发病机制相关的信号通路。方法:在GEO数据库中以“Age-related macular degeneration”为检索词,筛选芯片样本和种属,按照样本数量及匹配度排序,获得样本量最大的芯片数据GSE29801,利用R语言将芯片进行数据可视化转化,比较芯片各组间HGF和VEGF的表达差异;通过KEGG数据库分析AMD患者中表达增强的基因集,与生物体中作用已知的信号通路对比,得到可能与AMD发生相关的信号通路。结果:（1）对芯片组织HGF的表达分析显示:AMD患者与正常人眼在黄斑区外视网膜组织中表达量分别为14.75±7.29、12.53±7.30,在黄斑区外RPE-脉络膜复合体中表达量分别为8.97±2.66、9.06±3.32,在黄斑区RPE-脉络膜复合体组织中表达量分别为10.96±6.70、9.86±3.45,两两对比无统计学差异（P>0.05）。而黄斑区视网膜中HGF表达量有显著性差异（16.96±9.05 vs 11.78±5.10,P<0.05）,AMD患者黄斑区视网膜的HGF表达量明显升高。（2）对HGF的表达分析显示:AMD患者与正常人眼在黄斑区外视网膜组织中表达量分别为183.38±115.68、140.36±86.9,在黄斑区外RPE-脉络膜复合体中表达量分别为135.03±55.36、105.06±49.94,在黄斑区视网膜组织中表达量分别为160.11±104.72、111.53±57.91,在黄斑区RPE-脉络膜复合体组织中表达量分别为125.96±41.58、112.47±42.44,四组中AMD患者的VEGF整体表达呈增强趋势,差异在黄斑区外RPE-脉络膜复合体和黄斑区视网膜组织中具有统计学意义（P<0.05）。（3）KEGG结果:与正常人眼黄斑区视网膜组织相比,AMD患者黄斑区视网膜组织的1058个基因集中,有534个基因集表达上调,其中12个基因集的表达显著性增强（P<0.01）及49个基因集的表达增强（P<0.05）,其中发现S1P信号通路、SEMA4D相关信号通路Wnt信号通路等在AMD患者黄斑区视网膜组织中的表达明显增强。结论:GEO数据库分析发现AMD患者眼部黄斑区视网膜组织中HGF的表达有所增强,VEGF在RPE-脉络膜复合体和视网膜组织中表达均有所增强,说明HGF与VEGF参与了 AMD的发生;KEGG数据库分析发现AMD患者基因芯片表达增强的基因有部分基因参与了内皮细胞增殖迁移和血管生成的生物学过程。第二部分缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞中HGF含量的变化及外源性HGF蛋白对RF/6A细胞的影响目的:探讨ARPE-19细胞在缺氧不同时间段HGF和VEGF的表达及细胞因子的分泌情况,研究外源性HGF对RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力的影响。方法:（1）将生长状态良好的第7～8代ARPE-19细胞分为正常对照组和缺氧处理组,加入300μM氯化钴进行缺氧处理,收集Oh,2h,4h,8h,12h,24h各个时间段ARPE-19细胞的mRNA和蛋白,并收集24h的细胞上清液。Real-time RCR和Western Blot检测细胞中HGF和VEGF的mRNA和蛋白表达,ELISA法检测细胞上清中HGF、VEGF、CCL11、CCL24的蛋白含量。（2）生长状态良好的第7～8代RF/6A细胞分为正常对照组,5ng/mlHGF蛋白处理组,25ng/mlHGF蛋白处理组和50ng/ml HGF蛋白处理组,将细胞接种于96孔板和Transwell小室中,在不同外源性HGF蛋白浓度环境下培养,MTT法检测RF/6A细胞的增殖能力,Transwell小室法检测RF/6A细胞的迁移能力,采用matrigel胶血管形成实验检测RF/6A的管型形成能力。结果:（1）缺氧不同时间后ARPE-19细胞mRNA的表达:与正常对照组相比,HGF的mRNA水平在缺氧2h后开始增高（P<0.05）,在缺氧4h、8h后mRNA水平持续增加（P<0.05）,在缺氧12h后mRNA水平达到一个峰值（P<0.05）,12h之后mRNA水平逐渐降低（P<0.05）。而VEGF的mRNA水平在缺氧2h、4h仅有增高趋势（P>0.05）,从8h开始明显增加（P<0.05）,并持续至24h后（P<0.05）;（2）缺氧不同时间后ARPE-19细胞的蛋白表达:与正常对照组相比,HGF的蛋白表达在缺氧2h、4h并无明显变化（P>0.05）,从缺氧8h开始逐渐增高,持续至缺氧24h后（P<0.05）。VEGF的蛋白表达在缺氧2h、4h、8h无明显的改变（P>0.05）,缺氧12h、24h后VEGF蛋白表达显著性增高（P<0.05）;（3）ARPE-19细胞缺氧24h后细胞上清液中HGF、VEGF、CCL11、CCL24等细胞因子含量均显著性增加（P<0.05）;（4）5ng/ml外源性HGF蛋白对RF/6A细胞的增殖、迁移和血管形成能力无明显影响（P>0.05）,从25ng/ml浓度开始,HGF蛋白逐渐表现出促增殖、促迁移和促管型形成能力,50ng/ml的HGF蛋白促管型形成能力较25ng/ml更强_P<0.05。结论:在缺氧条件下HGF和VEGF的表达明显增强,分泌型细胞因子HGF、VEGF、CCL11、CCL24含量均有所增加,说明上述细胞因子参与了 RPE细胞的缺氧损伤过程;HGF蛋白可以通过调节内皮细胞的功能进而参与CNV的形成,上述几种细胞因子可能共同影响AMD的发生。第三部分共培养条件下HGF siRNA转染人视网膜色素上皮细胞对RF/6A细胞的影响及其相关机制探究目的:探讨共培养体系下,HGFsiRNA转染ARPE-19细胞后对RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力的影响,观察Dll4/Notch信号通路的变化。方法:（1）将生长状态良好的第7～8代ARPE-19细胞分为正常对照组、实验组、阴性对照组、转染试剂对照组,Real-time RCR和Western Blot检测HGF siRNA对mRNA和蛋白沉默效率;（2）将生长状态良好的第7～8代ARPE-19细胞分为正常对照组,氯化钴缺氧处理组及氯化钴+HGF siRNA处理组,在共培养体系下,观察ARPE-19细胞对RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力的影响,并检测各组ARPE-19细胞中HGF、VEGF、CCLs及Dll4/Notch信号通路的变化。结果:（1）Real-time PCR和Western Blot结果显示:与正常对照组相比,实验组RPE细胞中HGF的表达明显受到抑制（P<0.05）,mRNA和蛋白水平分别降低了 82%和66%,阴性对照组和转染试剂对照组RPE细胞中HGF的基因和蛋白表达均没有明显变化（P>0.05）,且转染试剂和siRNA对细胞的生长无明显毒副作用;（2）共培养体系中,氯化钴缺氧处理组的RF/6A细胞增殖、迁移和管型形成能力均有所增强（P<0.05）,氯化钴+HGFsiRNA处理组RF/6A增殖、迁移和管型形成能力明显下降（P<0.05）;（3）共培养24h后,缺氧状态下,ARPE-19细胞中HGF、VEGF、CCL11、CCL24的mRNA表达均显著性增强（P<0.05）,Dll4/Notch 信号通路中 D114、Notch1 的 mRNA 表达有所上升（P<0.05）,但 Notch4的表达没有明显变化（P>0.05）。经过HGF siRNA转染处理后,ARPE-19细胞中HGF、VEGF的mRNA表达均明显降低（P<0.05）,CCL11、CCL24的表达有下降趋势（P>0.05）,Dll4/Notch信号通路整体下调（P<0.05）。结论:HGF siRNA可以明显抑制ARPE-19细胞中HGF的基因和蛋白表达,并且可以逆转缺氧诱导的RF/6A细胞功能的增强,这种HGF可能通过调控D114/Notch信号通路及VEGF的表达调控内皮细胞的功能。