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真菌因其高分泌蛋白质的能力而备受关注,黑曲霉(Aspergillus niger)是一种常见的丝状真菌。黑曲霉在代谢过程中会产生多种高活性的酶,如α-淀粉酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、单宁酶等,而这些酶都具有重要的经济价值。其中,黑曲霉用于生产柠檬酸的应用最为广泛。实现黑曲霉的基因组编辑使其表型向更利于人类的方面发展,这有着重要的经济价值。但真菌转化难问题限制着真菌基因组编辑的研究。近年来,CRISPR系统(Clustered regμlarly interspersed short palindromic repeats)因其独特的优势,广受国内外科研工作者的青睐。CRISPR系统具有很大潜力能突破传统基因编辑方法的局限,但CRISPR系统黑曲霉中的应用还未有报道。本研究通过尝试将CRISPR系统应用于丝状真菌的基因组编辑,初步探究CRISPR系统在黑曲霉中的适用性及编辑效率。主要研究成果如下:(1)pCAMBIA1302-hFnCpf1 载体的构建。hFnCpf1 来源于Francisella novicida,是具有核酸内切酶活性的蛋白。使用PCR的方法从pcDNA3.1-hFnCpf1质粒上体外扩增目的hFnCpf1蛋白基因序列,再连接到pCAMBIA1302载体上(载体上携带潮霉素抗性基因)。在此过程中不引入任何冗余序列,保证了 hFnCpf1蛋白阅读框架的正确性,成功构建pCAMBIA1302-hFnCpf1载体。(2)农杆菌介导A.niger CBS513.88遗传转化系统构建。通过优化5个影响因素,建立了高效的转化体系。在这一转化体系中,以潮霉素为筛选标签,使用1.2×107个的孢子,通过三个平行实验获得的转化子数量为85个。成功将pCAMBIA1302-hFnCpf1稳定整合到A.niger CBS513.88的基因组上(pCAMBIA1302载体上的潮霉素抗性基因也随之整合A.niger CBS513.88的基因组上)。(3)sgRNA的设计与合成。综合考虑sgRNA的种子序列、靶标编辑位点(以潮霉素抗性基因为靶编辑基因)、发夹结构、PAM(protospacer adjacent motif)序列等,确定 sgRNA 所对应的 DNA 序列(5’-AATTAACCCTCACTAAAGAATTTC TACTGTTGTAGATTGCGGCCATTGTCCGTCAGGACA-3 ’)。随后,以该双链DNA序列为模板体外转录获得sgRNA。相比于直接合成sgRNA,体外转录的方法更为经济。(4)验证 CRISPR/Cpf1 系统在A.niger CBS513.88 中的适用性。以 A.niger CBS513.88基因组上的潮霉素抗性基因为靶编辑基因,通过电击转化的方法将外源的 sgRNA 瞬时导入到A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1 中。以潮霉素抗性基因为筛选标签,结合测序的方法寻找目的突变子并进行分析。本研究对10个突变子序列进行BLAST对比,分析突变的位点。并使用Clustal X软件对突变子的表达框架进行分析,并对实验结果进行讨论。本研究为CRISPR系统首次应用于黑曲霉的基因组编辑,扩充了 CRISPR系统在丝状真菌中的应用。