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皮肤移植是治疗深度烧伤和其他皮肤缺损的关键手段。现在皮肤移植所需的皮源主要有自体皮、同种异体皮、异种皮及人工皮。自体皮来源于患者自身，移植后无排异反应，可永久成活，是最理想的皮肤移植材料。但对大面积烧伤患者来说，自体皮常常不足。另外对于其他需植皮的病人来说，供皮区的疼痛和瘢痕也是难于接受。异体(种)皮体因其免疫原性只能用作创面的临时覆盖物，而且携带病毒传播疾病的可能性使得应用越来越谨慎。人工皮肤研究很早，一直徘徊在临时覆盖物的阶段。近几年组织工程的兴起又激发了人们的研究兴趣，尤其是干细胞的发现和分子生物学的进步，使得皮肤组织工程种子细胞的问题有了解决希望。干细胞领域中位于中游能够比较方便得到的骨髓间充质干细胞(MSCs)又特别引人注目。 MSCs是一种具有多向分化潜能的细胞，在特定的条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、骨髓基质细胞、血管内皮细胞及神经细胞样细胞分化。间充质干细胞存在于多种组织中，如骨髓、骨膜、胸腺、皮肤、脂肪和肌肉等。其中，骨髓MSC易于分离纯化，在体外具有极强的增殖能力，抽去少量的骨髓即可满足细胞治疗的需要，是目前组织工程和创伤愈合研究中常用的细胞。自20世纪70年代中期Friendenstein等建立了骨髓MSC分离培养方法以来，人们对MSC浙江大学硕士研究生学位论文的特征和多向分化性进行了深入的研究。人骨髓MSC的分离方法有多种，如梯度离心后根据MSC的贴壁性进行纯化、利用细胞的表面标志进行负性富集和正性富集以及比较先进快速的免疫磁珠法等。目前普遍采用的培养方法是对Fri edenstein建立的方法的改进。培养体系中加入多种生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)和表皮生长因子(EGF)等，获得的细胞似乎有更强的分化能力。近年来的研究表明成人骨髓细胞还能在体内分化为其他多种组织中成熟的非造血细胞，如肝、肾、肺、皮肤、胃肠道的上皮细胞，心脏和骨骼肌的肌细胞。 虽然目前有较多关于MSC多向分化性的研究，但多数研究是在动物体内和人体内的实验，对于MSC的体外分化的研究也主要集中在向骨、软骨、脂肪和神经细胞的分化，而对向上皮细胞分化的研究未见报道。本研究根据MSC具有多向分化的潜能及己在体内证明MSC能向各种组织的上皮细胞分化的报道，来探索MSC在体外向表皮样上皮细胞分化的可能性研究目的 体外分离、培养、扩增人骨髓间充质干细胞，用特殊的诱导培养基培养后，检测其是否表达表皮样上皮细胞标记物，探索骨髓间充质干细胞在体外向表皮样上皮细胞分化的可能性，为今后的研究奠定基础。材料和方法 取浙江大学医学院附属第一医院和第二医院检查无造血系统恶性疾病的成人骨髓标本共n例。按改良的Fri endenstein建立的方法，分离骨髓标本，取单个核细胞培养传代。待细胞增殖至3.6x1)(12个75Cm2的塑料培养瓶)，分三组(M‘，、Ml、M:组)每组各4瓶，分别用三种不同的培养基(M(。、M，、M:)培养。M‘，组用常规培养基培养，即L一DMEM+10%FBS+100U/ml青链霉素双抗(简称M。);Ml组在常规培养基基础上添加20ng/m1EGF、loug/mllnsuzin、sug/ml RetinoiCAeid、16.65ug/ml Cae12(简称MJ);MZ组在M，组培养基的基础上添加Zong/mlFGFs(简称MZ)。各组中，部分细胞用75 Cm，的塑料培养瓶培养，部分接种于浙江大学硕士研究生学位论文培养皿中的玻璃片上培养。待细胞增殖至90%以上汇合时，用消化液(0 .25%TryPsin:0 .02%EDTA=l:3)消化收集每组细胞，行流式细胞分析检测上皮细胞标记物P63、广谱细胞角蛋白(Pan一eytokeratin，pan一CK)、细胞角蛋白19(Cytokeratin19，CK19)和上皮特异性抗原(Epithelia Speeifie Antigen，ESA)的表达情况。玻璃片上的细胞用来做免疫组化，检测上述四种标记物。结果一MSCS的分离培养和扩增 Percoll分离液(l .073g/ml)分离得到的单个核细胞24小时后贴壁，细胞呈圆形，48一72小时后呈纺锤形、梭形、多角形，增殖缓慢，原代培养约14一20天左右可达到80一90%融合。传代细胞24小时内完全贴壁，1:2传代时，4一5天达到90%以上汇合:1:3传代时，5一7天内达到90%汇合。二.上皮细胞标记物的免疫组化结果 ESA Pan一CK CK19 P63 M。组:阴性阴性阴性阴性 MI组:弱阳性阴性阳性阳性 M:组:阳性弱阳性阳性强阳性三.上皮细胞标记物的流式分析结果 ESA，Pan一CK，CK19和P63的阳性表达率(%) ESA Pan一CK CK19 P63 M(，组9 .74 10.74 4.99 5.89 M.组7 .43 1 1 .14 9.01 15.52 M，组12.10 12.83 9.68 8.28结论:1.MSC在特殊的培养条件下有向表皮样上皮细胞分化的可能性。2.P63可作为上皮祖细胞和表皮细胞的标记物。