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目的:观察晚期糖基化终产物(advanced glycation endproducts AGEs)对人内皮细胞中自噬的诱导,并探讨自噬在动脉硬化内皮细胞损伤中的作用。方法:1.收集糖尿病合并动脉粥样硬化(Atherosclerosis AS)患者手术切除的颈动脉动脉粥样硬化斑块,通过HE染色、荧光免疫染色并利用内皮细胞特异性标记物vWF,标记血管内皮细胞;通过透射电镜观察细胞超微结构及自噬的发生;荧光免疫染色观察自噬特异标记物MAP1-LC3(microtubule-associated protein light chain 3)的表达;观察人颈动脉粥样硬化斑块中内皮细胞的分布及自噬泡的形成。2.运用不同浓度的糖基化-牛血清白蛋白(advanced glycation endproduct-bovine serum albumin AGE-BSA)作用不同时间来处理人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells HUVECs),透射电镜观察细胞超微结构;MDC自噬囊泡染色;应用免疫印迹技术检测自噬特异性标识蛋白LC3-II/β-actin及溶酶体相关膜蛋白Lamp1的表达,并用荧光免疫标记MAP1-LC3,以此评价AGE-BSA对HUVECs自噬水平的影响。3.自噬诱导剂雷帕霉素和抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine 3-MA)干预后,应用MTT法检测细胞生存率;酶联免疫技术检测培养上清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase LDH)含量,了解自噬对AGE-BSA造成的HUVECs损伤的影响。4.通过流式细胞技术检测培养基上清中活性氧物质(reactive oxygenspecies ROS)含量;并用抗氧化剂维生素E(α-tocopherol)干预,以探讨氧化应激在AGE-BSA诱导自噬中的作用,进一步探讨自噬在AGE-BSA诱导的内皮细胞损伤中的作用。结果:1.通过HE染色及荧光免疫染色,我们发现,在糖尿病患者颈动脉粥样硬化斑块纤维帽、内膜结合区(即动脉粥样硬化肩部)以及脂质坏死区边缘有较多的新生血管内皮细胞,新生血管内皮细胞中MAP1-LC3表达较正常血管内皮细胞增加。透射电镜可观察到新生血管内皮细胞中的大量自噬产生。2. MDC染色、荧光免疫细胞染色和透射电镜结果均显示AGE-BSA处理后可诱导HUVECs发生自噬;免疫印迹技术结果显示AGE-BSA可上调HUVECs LC3-II/β-actin、Lamp1蛋白表达,且此作用在6 h达到高峰。同时自噬抑制剂3-MA能够抑制AGE-BSA诱导的HUVECs自噬,而自噬诱导剂雷帕霉素能够促进HUVECs自噬的发生。3. AGE-BSA处理HUVECs 6 h,抑制了细胞增殖,自噬抑制剂3-MA能够明显促进AGE-BSA对细胞增殖的抑制,而自噬诱导剂雷帕霉素能够缓解AGE-BSA对细胞增殖的抑制。AGE-BSA处理HUVECs后,造成LDH漏出率明显增加,而自噬抑制剂3-MA能进一步增加AGE-BSA诱导的细胞上清LDH的漏出,自噬诱导剂雷帕霉素对AGE-BSA诱导的细胞上清LDH的漏出无影响。4. AGE-BSA处理能够增加HUVECs胞内活性氧(ROS)水平增加。抗氧化剂α-tocopherol不仅能够降低AGE-BSA诱导的胞内ROS水平,同时能抑制AGE-BSA诱导的LC3-II/β-actin表达上调。结论:糖尿病病人颈动脉粥样硬化不稳定斑块的内皮细胞中存在自噬现象;AGE-BSA(100μg/ml)能在一定时间增加体外培养的HUVECs细胞株的自噬水平,在6 h达到高峰。而自噬增加能减少AGE-BSA诱导的细胞损伤及LDH漏出率,在AGE-BSA诱导的内皮细胞损伤中发挥保护作用;ROS参与了AGE-BSA诱导的内皮细胞自噬水平上调。