多肽是一类在多种疾病的治疗领域很有潜力的药物先导物,多肽的环化可以增强多肽的亲和力,稳定性以及选择性。在多种多肽环化方式中,利用二硫键环化多肽是最常用也是非常特别的一种。二硫键是许多蛋白和多肽翻译后修饰中最重要的用于限定构型的共价键,例如胰岛素家族、芋螺毒素家族、防御素家族的多肽中就含有多对二硫键。在氧化环境中,两个半胱氨酸侧链可以通过自发氧化反应形成二硫键,二硫键的形成不需要引入非天然氨基酸,反应十分高效且过程中基本没有副反应。二硫键这些性质使得它成为了环肽库的构建中最流行的连接键,人们通过在多肽中引入一对、两对或三对二硫键构建了单元环肽和多元环肽库,并利用这些环肽库对靶标进行了筛选。通过多对二硫键构建的二元环肽和三元环肽等多元环肽和单元环肽相比,构型更加的多样,结构更为受限,刚性更强,因此它们的结构稳定性和抗蛋白酶水解能力比单元环肽更强。但是多对二硫键在生物体液等弱还原环境中会发生重排,可能会使有活性的二元环肽转变为其没有活性的同分异构体,比如四个半胱氨酸的多肽氧化会形成三种同分异构体,而在这些同分异构体中,通常只有一种是有活性的,因此引入固定二硫键配对方式限制多肽构型的方法是十分重要的。在我们课题组前期的研究中,通过在有四个半胱氨酸的多肽中引入“CXC”基序以及利用半胱氨酸和青霉胺(Cys-Pen)正交配对的方法,可以构建不会发生重排异构的熔环型和桥联型的二元环肽。在本论文中,我们把这种方法应用到多肽的高通量筛选中,得到了对靶标具有高亲和力并且不会发生重排异构的二元环肽。本论文一共分为三章,包括以下主要内容:第一章:主要介绍了多种多肽环化方法及连接键的性质,还综述了几种通过二硫键构建的多肽噬菌体库、噬菌体展示的基本概念以及普遍应用的限制二硫键配对的手段,最后提出了本论文的研究思路及意义。第二章:建立了噬菌体展示平台,构建了噬菌体库低拷贝的展示GCXCX5CX5C序列多肽,利用此噬菌体库对靶标蛋白Keap1 Kelch Domain(Keap1)及人血浆激肽释放酶(Plasma Kallikrein)进行了三轮筛选,得到了一系列有活性的二元环肽序列,体外合成了部分序列,对其活性进行测定,还对和Keap1蛋白亲和力较高的两条二元环肽(XM-3 Isomer 1及XM-10 Isomer 1)进行了重排异构稳定性测试,发现它们在弱还原性环境中会快速发生重排,同时,还将这两条多肽的活性及酶解稳定性与同源线性肽和单元环肽进行了对比。第三章:将XM-2、XM-3和XM-10中的两个半胱氨酸(Cys)选择性地替换为青霉胺(Pen),对这些青霉胺替代的二元环肽的活性进行测定,发现替代后的多肽中,XM-3 p2、XM-10 p1及XM-2 p1能够保留甚至高于同源4-Cys二元环肽的活性,对XM-3 p2及XM-10 p1重排异构稳定性进行测试,证明了它们在弱还原性环境中不会发生重排,我们还利用二维核磁鉴定了 XM-3 Isomer 1及XM-3 p2中的二硫键配对方式。最后,对本文中研究内容进行了总结和展望。