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[目的]Na+-K+-ATP 酶(Na+-K+-ATPase)是 ATP 酶(ATPase)中最具代表性的一种类型酶,控制钠离子和钾离子的跨膜运输,是调节脑内兴奋性的主要因子之一,但Na+-K+-ATPase在癫痫发生发展中的变化未定。课题组前期研究发现癫痫脑内calponin-3蛋白在星形胶质细胞和神经元内异常表达,且参与调控癫痫的易感性,但具体作用环节尚不清楚。Calponin-3蛋白可调控ATPase活性,本实验拟明确Na+-K+-ATPase在癫痫发作后的变化,探讨其变化是否与calponin-3相关及其意义。[方法]雄性成年C57BL/6小鼠给290mg/kg匹罗卡品腹腔注射诱导癫痫持续状态成功后,随机分为点燃后1小时组(1H)、6小时组(6H)、24小时组(24H)、3 天组(3D)、1 周组(1W)、2 周组(2W)、1 月组(1M)、2月组(2M),在规定时间点取出海马,再采用定磷法检测ATPase和Na+-K+-ATPase的活性,RT-qPCR 检测 Na+-K+-ATPase 的 α1、α2、a3、β2 亚型(ATP1α1、ATP1α2、ATP1α3、ATP1β2)及 CNN3(编码 calponin-3 蛋白)的转录水平,Western blot检测calponin-3、Na+-K+-ATPase、ATP1α1的蛋白表达量,免疫荧光分析ATP1α1与ca1ponin-3在脑组织内的表达及细胞水平定位。通过RT-qPCR技术又定量检测年龄、性别匹配的难治性颞叶癫痫患者和非癫痫对照患者术后颞叶脑组织内CNN3与Na+-K+-ATPase的三个亚型的mRNA水平。最后采用Pearson直线相关分析方法分析CNN3与Na+-K+-ATPase及其亚型之间的相关关系。[结果]注射匹罗卡品的实验鼠共138只,有127只(92.03%)出现Ⅳ级以上的癫痫发作,在癫痫发作持续1小时注射地西泮后106只小鼠发作终止。之后共有22只癫痫小鼠死亡,其中在24H的死亡率最高,为11.43%,而在2M无实验鼠死亡。在酶活性,癫痫点燃后,实验鼠海马的ATPase活性开始下降,至24H降为最低,之后又逐渐上升;而Na+-K+-ATPase活性也有相似变化,但仅在1M较24H的增加具有统计学意义。Pearson分析显示ATPase活性变化与癫痫小鼠各组死亡率呈负相关,与Na+-K+-ATPase活性变化呈正相关。在转录水平,与非癫痫颞叶组织比较,难治性癫痫患者颞叶脑组织内CNN3的mRNA表达显著上调,Na+-K+-ATPase的α2亚型mRNA表达显著降低,两者之间的Pearson相关系数为-0.379(P<0.05)。与空白对照鼠组织相比,癫痫小鼠的CNN3在24H、3D、1W、2W表达显著升高;Na+-K+-ATPase的α1亚型在3D表达显著下降,但在2W、1M、2M时表达又较3D时呈有统计学意义的升高;Na+-K+-ATPase的α2及β2亚型在1M表达显著增多;Na+-K+-ATPase的α3亚型在1H、1M表达显著减少;相关性分析显示癫痫小鼠海马内CNN3仅与Na+-K+-ATPase的α1亚基在转录水平上存在负相关关系(P<0.05)。在蛋白水平,calponin-3在点燃后24H、3D、1W、2W和1M升高;Na+-K+-ATPase在24H的表达降低,但在3D、1M、2M表达又较24H组增多,各项差异均有统计学意义;Na+-K+-ATPase的α1亚基在1M的表达上升;Pearson分析提示calponin-3与Na+-K+-ATPase及α1亚型蛋白水平的变化间无相关性。免疫荧光染色显示:Na+-K+-ATPase的α1亚型与calponin-3在点燃后3天小鼠海马伞和颞叶皮质的星形胶质细胞内共染。[结论]癫痫发生后,海马内ATP酶、Na+-K+-ATP酶及calponin-3均发生改变。ATP酶活性在癫痫发作持续状态24H降至最低,而癫痫鼠的死亡率最高。Na+-K+-ATP酶活性变化与ATP酶活性变化不完全一致,因为酶活性、转录水平和细胞定位三个层面均提示Na+-K+-ATP酶的变化与calponin-3有关,但Na+-K+-ATP酶的不同亚型与calponin-3的相关性不同。Na+-K+-ATP酶的α1亚型与calponin-3在星形胶质细胞内共表达,表明calponin-3最可能通过调节α1亚型Na+-K+-ATP酶参与构成三重突触而影响癫痫易感性,这为防治耐药性癫痫提供了新的思路和靶点。