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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种高度接触性传染病,临床症状主要是以母猪的繁殖障碍,仔猪呼吸道症状以及哺乳仔猪的高死亡率为特征。猪群会因感染PRRSV后所造成的持续性感染以及继发性感染,而导致猪群的生产性能下降,对养猪业造成了极大的经济损失,是目前影响养猪业健康发展的重要的疫病之一。PRRSV极易发生变异,流行毒株众多,而商品化弱毒疫苗的使用,也会导致流行毒与疫苗毒重组现象的发生,造成PRRS防控难度加大。诱导保护性免疫应答的PRRSV抗原结构仍然不是很清楚,有必要研制PRRSV不同结构蛋白的单克隆抗体,解析PRRSV的抗原结构,发现诱导中和抗体甚至广谱中和抗体应答的抗原表位,为PRRSV防控产品的研究提供理论依据。本研究中,利用多种商品化的PRRS弱毒疫苗和实验室自制流行毒株疫苗免疫猪,以诱导产生较高水平的中和抗体。同时纯化全病毒抗原,并用生物素标记病毒粒子;在第八次免疫后采集0922#猪的静脉血,分离外周血中的单核细胞(PBMCs),以生物素标记的PRRSV为捕获抗原,通过流式细胞分选技术,从PBMCs中分选出抗原特异性抗体分泌单个B细胞。通过单个B细胞抗体基因扩增技术,获得猪IgG抗体重链和轻链可变区(VH和VL)基因序列,然后将可变区基因序列插入到含有猪IgG抗体恒定区的pcDNA3.4真核载体中,构建出完整的抗体表达质粒。将IgG抗体的表达质粒,转染适应悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S),进行抗体的小量表达,然后用间接免疫荧光试验(IFA)验证小量表达抗体识别PRRSV的特异性,将特异性反应的抗体进行大量表达与纯化。纯化后的抗体通过IFA、微量病毒中和试验(VNT)、Western blot(WB)等试验验证抗体的活性与功能。结果表明,通过蔗糖密度梯度离心,成功纯化出了PRRSV病毒粒子,电镜观察病毒粒子呈椭圆形,直径为50-80 nm。采用不同的弱毒疫苗或自制病毒疫苗反复免疫后,针对疫苗弱毒VR2332,GSWW/15(HP-PRRSV样毒株)与GSWW/18(类NADC30样毒株)流行毒的中和抗体效价最高分别可达1:45,1:256,1:45。通过本研究共鉴定出9株PRRSV特异性单克隆抗体,9株抗体均特异性结合PRRSV的核衣壳蛋白(N蛋白),均没有病毒中和活性,IFA、WB试验均具有很好的反应性。综上所述,本研究基于单个B细胞抗体技术,获得了9株PRRSV特异性单克隆抗体,均识别PRRSV N蛋白,说明N蛋白具有很强的免疫优势性,本研究为筛选PRRSV中和性单克隆抗体积累了经验,也为解析N蛋白中的抗原表位提供了抗体工具。