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背景和目的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是临床常见的呼吸系统急危重症,病死率高,发病原因复杂,发病机制尚未完全阐明,已成为临床危重病学研究的热点和难点。脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是引起急性肺损伤(acute lung injury,ALI)禾口肺部感染最常见的因素之一,而急性肺损伤和肺部感染也是缺血-再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)引起各种并发症中最常见的致死原因。研究表明在急性脑缺血后2h发生急性肺损伤和肺水肿。目前, CIRI致ALI发生的机制尚不完全清楚。因此,研究CIRI致ALI发生的作用和机制对临床上防治脑缺血-再灌注致急性肺损伤具有重要的价值和意义。肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cells, PMVEC)损伤在ALI发病机制中起着重要作用。研究表明,肺微血管内皮屏障功能与内皮细胞间紧密连接和血管内皮产生的NO调控密切相关。内皮细胞间紧密连接与蛋白激酶Ca(PKCa)和肌球蛋白轻链(MLCK)有关。PKCa与MLCK被认为是调控PMVEC损伤最关键的蛋白质,PKCa与微血管内皮细胞骨架蛋白的重排有关,PKCa激活后,引起下游效应蛋白(骨架蛋白)磷酸化,最终激活MLCK,使肌球蛋白轻链(MLC)发生磷酸化,介导肌球-肌动蛋白间相互作用,从而引起内皮细胞的收缩,最终导致细胞旁间隙形成、血管通透性增加。因此,研究PKCa和MLCK在急性肺损伤微血管通透性改变中的作用对揭示急性肺损伤的发病机制具有重要意义。新近研究证实不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)是一氧化氮合酶(NOS)的强烈抑制剂,被认为是血管内皮细胞损害的一种重要的危险因子,在许多疾病的发生发展中起重要作用。研究发现,ADMA在蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methytransferases, PRMT)作用下产生,其代谢被二甲基精氨酸二甲氨水解酶(dimethylargininedimethy laminohydrolase, DDAH)降解,经肾脏排出体外,即ADMA/DDAH通路。PRMT(?)DDAH控制着ADMA在体内的浓度。因此,研究ADMA/DDAH通路可为抗脑I/R致急性肺损伤提供药物干预作用的新靶点。本研究从整体、细胞和分子水平上研究ADMA/DDAH通路在脑I/R致ALI中作用机制,旨在为脑缺血-再灌注致肺损伤的防治提供科学的理论与实验依据。方法第一部分脑缺血-再灌注致肺损伤模型的建立参照zea-Longa线栓改良法复制大鼠脑缺血-再灌损伤模型,采用大鼠神经功能缺损评分标准(0-4分),入选大鼠标准分值为3分,评价大鼠脑缺血-再灌注损伤程度。随机将大鼠分为假手术组和模型组。显微镜观察肺组织的病理改变,测定肺组织湿/干重量(W/D)比值,双抗体夹心法测定肺组织中髓过氧化物酶(MPO)活性,硫代巴比妥酸显色法检测肺组织MDA的含量,计数支气管肺泡灌洗液中的白细胞,评价大鼠脑缺血-再灌注致急性肺损伤程度。第二部分ADMA/DDAH通路在脑缺血-再灌注大鼠肺损伤中的作用机制在第一部分确定的模型基础上,实验分为①假手术组(S)②模型组(I/R)③ADMA干预组(ADMA+I/R)和④DDAH干预组(DDAH+I/R).在脑缺血-再灌注损伤24h时观察各项指标：硝酸还原酶法和化学比色法测定肺组织NO含量；高效液相色谱(HPLC)测定支气管肺泡灌洗液中ADMA含量；western blot和RT-PCR技术检测肺组织中PKCα、MLCK蛋白和mRNA的表达。从整体水平上评价ADMA/DDAH通路在脑缺血-再灌致急性肺损伤中的作用。第三部分PKCα和MLCK蛋白在肺微血管内皮细胞通透性中的作用分离培养大鼠PMVEC,随机分为4组。①正常血清组：加入正常大鼠血清；②假手术血清组：加入假手术大鼠血清；③抑制剂组：加入PKCα抑制剂A-3.hydrochloride:④模型血清组：加入脑缺血-再灌损伤模型大鼠的血清。共聚焦显微镜检测PMVEC中PKCα、MLCK蛋白的表达：双抗体夹心法测定细胞中PKCα、MLCK蛋白和ADMA浓度：硫代巴比妥酸显色法检测细胞MDA的含量。从细胞水平上评价PKCa和MLCK蛋白在肺微血管内皮细胞损伤中的作用。第四部分ADMA/DDAH通路在肺微血管内皮细胞通透性中的作用机制体外培养PMVEC,随机分为6组。①正常灭活血清组：加入等量的正常灭活血清；②正常非灭活血清组：加入等量的正常非灭活血清；③模型灭活血清组：加入等量的模型灭活血清；④模型非灭活血清组：加入等量的模型非灭活血清；⑤ADMA组：加入20g/L0.5mL ADMA;⑥DDAH组：加入20g/L0.5mL DDAH。共聚焦显微镜观察PMVEC的PKCα、MLCK蛋白的表达；MTT检测细胞活性及增殖状况；western blot和RT-PCR技术检测培养液中PKCα、MLCK蛋白和mRNA的表达；免疫组化测定PMVEC中PKCa和MLCK蛋白表达。从细胞水平上评价ADMA/DDAH通路在大鼠脑缺血-再灌注对肺微血管内皮细胞通透性中的作用机制。结果第一部分与假手术组比较,模型组肺组织MPO活性、MDA含量升高(P<0.05), W/D比值升高(P<0.05),模型肺泡灌洗液中性粒细胞计数升高(P<0.01),假手术组(S组)除部分区域见毛细血管扩张充血等轻微炎症反应外,无明显病理改变,模型组(I/R组)肺组织弥漫性充血、出血,肺泡腔可见有散在红细胞及炎细胞浸润,肺泡壁充血、增厚、渗出。第二部分ADMA测定结果显示：与S组和DDAH+I/R组比较,I/R组和ADMA+I/R组BALF-ADMA、入肺血-ADMA、入/出肺血ADMA比值都明显增高,具有统计学意义(P<0.05),而S组与DDAH+I/R组之间比较无统计学意义,ADMA+I/R组与I/R组之间比较也同样无统计学意义。KCα和MLCK检测结果：与S组和DDAH+I/R组比较,I/R组和ADMA+I/R组肺组织中组织PKCa和MLCK蛋白在缺血再灌注后24h表达明显增强,而S组与DDAH+I/R组比较,PKCa和MLCK蛋白无统计学意义,ADMA+I/R组与I/R组比较也无统计学意义PKCa和MLCK mRNA表达变化与各自相应的蛋白变化相一致。NOS和NO检测结果：与S组比较,I/R组肺组织NOS活性、NO含量降低(P<0.05或0.01)；ADMA+I/R组与S组相比较,肺组织NOS活性、NO含量稍增高,但无统计学意义,DDAH+I/R组的表达情况与ADMA+I/R组相反。第三部分结果显示：与正常血清组、假手术血清组和抑制剂组比较,模型血清组MDA含量升高(P<0.05),而正常血清组、假手术血清组和抑制剂组三组之间MDA含量比较无显著性差异；共聚焦显微镜观察大鼠PMVEC中PKCa、MLCK含量及定位的检测结果与MPO活性、MDA含量检测结果相一致,与正常血清组和假手术血清组比较,抑制剂组和模型组大鼠PMVEC中ADMA含量明显升高(P<0.05)。第四部分Western blotting检测结果：与ADMA组比较,模型灭活血清组PKCa和MLCK、蛋白表达差异无显著性,而同样正常灭活血清组、正常非灭活血清组、模型非灭活血清组及DDAH组这四组中PKCa和MLCK蛋白表达相互比较差异也无显著性(P>0.05)；但模型灭活血清组和ADMA组与其余四组中PKCa和MLCK蛋白表达比较有显著差异(P<0.05)。RT-PCR检测大鼠PMVEC中PKCa和MLCKmRNA表达的结果同Western blotting检测结果相一致。共聚焦显微镜和免疫组化检测结果：大鼠PMVEC中PKCa和MLCK含量及定位情况同Western blotting检测结果相一致。细胞活性检测结果：与正常灭活血清组、正常非灭活血清组、模型非灭活血清组及DDAH组OD值(λ=490波长)比较,模型灭活血清组和ADMA组的OD值显著下降(P<0.05)。小结1.改良zea-Longa线栓法可成功复制脑缺血-再灌注导致急性肺损伤模型,为后续深入研究脑缺血-再灌注致急性肺损伤作用机制提供可靠的实验动物模型。2.脑缺血-再灌注致急性肺损伤时肺组织中ADMA含量明显增高,NOS活性和NO含量降低,PKCa、MLCK蛋白和mRNA表达增高：外源性ADMA能够上调脑缺血-再灌注致急性肺损伤时肺组织中PKCc、MLCK蛋白和mRNA表达,加重肺损伤程度；反之,外源性DDAH能够下调脑缺血-再灌注致急性肺损伤时肺组织中PKCa、MLCK蛋白和mRNA表达,减轻急性肺损伤程度。ADMA/DDAH通路在脑缺血-再灌注致急性肺损伤发生中起重要作用。3.脑缺血-再灌注大鼠血清高浓度ADMA能够增加PMVEC中PKCa、MLCK蛋白量和MDA含量,PMVEC细胞活性下降,PMVEC损伤。PKCa抑制剂明显地抑制PKCa和MLCK蛋白的含量,可能具有增加PMVEC通透性的作用。PKCa和MLCK这两种蛋白在脑缺血-再灌注致急性肺损伤PMVEC细胞通透性中起重要作用。4.脑缺血-再灌注大鼠非灭活血清(高浓度ADMA)能够上调体外培养的大鼠PMVEC中PKCa和MLCK蛋白和mRNA表达,抑制PMVEC的增殖和生长,反之,其灭活血清(高浓度DDAH)能够降低ADMA含量,下调体外培养的大鼠PMVEC中PKCa和MLCK蛋白和mRNA表达,促进PMVEC的增殖和生长。ADMADDAH通道在调控PKCa和MLCK蛋白表达起重要作用。结论ADMADDAH通路在脑缺血-再灌注致急性肺损伤的发病机制中起重要作用,其作用机制可能与调控NO的含量,上调PKCa和MLCK蛋白表达,增加PMVEC细胞通透性密切相关。