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孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder,ASD)是一种先天性中枢神经发育障碍性疾病,其主要临床症状为社交缺陷、重复刻板行为、语言交流困难、智力发育迟缓、感觉减退或超感觉等。ASD的发病率逐年升高,我国的发病率已达1%左右。因此ASD已经被认为是一种常见的终身性的神经发育障碍,近年来已成为备受关注的公共健康问题。胚胎期和出生后的中枢神经发育过程是一系列时间和空间上受到精确调控的生物学过程。ASD发病机制的神经发育假说认为,ASD是在个体发育早期由遗传和发育早期环境因素共同作用,造成神经元增殖和分化、神经元形态和突触发育异常,从而导致神经系统功能障碍。大量神经影像学和神经病理学研究报道了ASD患者在发育早期的神经解剖异常:在6-24月龄常出现某些脑区不同程度的过度发育,而在儿童期或青少年期,这些区域的发育往往又较正常儿童减缓。这些结构的异常可能干扰神经元群体间正常联系的建立,信息加工处理方式异常,从而影响对社会交往、语言、认知和运动等方面的调控,但导致这种神经发育障碍的具体机制尚不清楚。颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN),是一种具有神经生长因子活性的分泌性生长因子,广泛参与生长发育、损伤修复、炎症及代谢调控等生理和病理反应。PGRN目前已被证实可减少神经元凋亡,促进其存活,参与突触形成和突起生长。PGRN基因敲除小鼠表现出运动功能障碍、空间学习记忆障碍、焦虑和社会行为障碍等神经功能症状。并且在ASD患儿血清样本中发现PGRN含量显著降低。因此,在ASD患者神经系统发育过程中可能存在PGRN的异常表达,进而改变神经元凋亡和突触发育的正常进程,导致ASD相关的神经功能障碍。但目前尚无文献报道PGRN在ASD患者脑组织中的表达情况及其与神经系统发育的关系。第一部分VPA诱导的SD大鼠与C57小鼠ASD模型比较目的:比较丙戊酸(Valproic acid,VPA)诱导的C57小鼠和SD大鼠ASD模型的异同,为后续实验选择适宜的动物模型。方法:1.动物模型:孕12.5天C57小鼠和SD大鼠,VPA组腹腔注射600mg/kg VPA,对照组注射等量生理盐水。2.分组:VPA组和对照组的C57小鼠:VPA-M组和CON-M组。VPA组和对照组的SD大鼠:VPA-R组和CON-R组。3.检测指标:(1)孕鼠的出产率、新生仔鼠的畸形率、仔鼠4日存活率。(2)体重、尾长、睁眼、门齿萌出、腹毛生长阳性天数等检测仔鼠生长发育情况。(3)平面翻正、断崖回避、空中翻正、直线爬行、抓杆实验、转体、听觉惊愕反射阳性天数检测仔鼠神经系统发育情况。(4)旷场实验、三箱社交实验和自我捋毛实验检测仔鼠的ASD样神经行为学改变。结果:1.相较于CON-M组,VPA-M组孕鼠的出产率明显降低,新生仔鼠的外观畸形率显著升高,4日存活率降低,而VPA-R组与CON-R组的上述指标均无明显差异。2.VPA-M组较CON-M组出现明显的生长发育迟缓,体重明显轻于CON-M组、门齿萌出和睁眼阳性天数延迟;而VPA-R组的体重虽也明显轻于CON-R组,但门齿萌出和睁眼阳性天数无明显延迟。3.VPA-R组与CON-R组相比,平面翻正、断崖回避、直线爬行、抓杆实验、听觉惊愕实验和空中翻正阳性天数均有显著差异,表现出明显的神经系统发育迟缓;VPA-M组与CON-M组相比,仅转体、抓杆实验和听觉惊愕实验阳性天数有明显差异。4.在旷场实验中,VPA-M组仅纵向垂直得分低于CON-M组。VPA-R组穿越中央格和纵向垂直得分均低于CON-R组。5.三箱实验显示,第一阶段中,VPA-R组与CON-R组相比,在stranger1箱体中停留时间、与stranger1嗅触时间、与物体嗅触时间均明显减少,在物体箱体停留时间明显增加;VPA-M组与CON-M组相比上述指标均无明显差异。第二阶段中,VPA-R组与CON-R组相比,在熟悉鼠stranger1箱体停留时间明显增加,在陌生鼠stranger2箱体停留时间、与熟悉鼠stranger1嗅触时间和与陌生鼠stranger2嗅触时间均显著减少;VPA-M组与CON-M组相比,在熟悉鼠stranger1箱体停留时间和与熟悉鼠stranger1嗅触时间明显增加,在陌生鼠stranger2箱体停留时间减少,但与陌生鼠stranger2嗅触时间无明显差异。6.VPA-M组与CON-M组之间自我捋毛时间无显著差异,VPA-R组捋毛时间明显长于CON-R组。结论:孕中期C57小鼠和SD大鼠经VPA注射后,子代均可出现不同程度的孤独症谱系障碍核心症状,但C57小鼠神经系统发育滞后和ASD相关神经行为学改变程度较SD大鼠轻,且C57孕鼠的出产率和仔鼠存活率低,仔鼠畸形率高。因此,从模型表观效度、建模成本和动物伦理学等方面综合考虑,使用SD大鼠制备VPA诱导ASD模型优于C57小鼠。第二部分PGRN在VPA诱导的ASD大鼠脑组织中表达的时空规律及其对神经发育作用的初步研究目的:本研究采用VPA诱导的ASD大鼠模型,观察PGRN在脑组织中表达的时空规律,及其与神经元凋亡和突触相关蛋白表达的关系,初步探讨PGRN是否参与ASD的发生及其可能机制。方法:1.动物模型和分组:SD大鼠(E12.5)腹腔注射600 mg/kg VPA(VPA组),或注射等量生理盐水(CON组)。2.检测指标:(1)Western blot检测各组仔鼠在出生后(postnatal,PN)7、14、35和72 d,额叶皮层、颞叶皮层、海马和小脑中PGRN、PSD95和SYN蛋白的表达情况。(2)免疫荧光技术观察各组仔鼠在上述时间点,额叶皮层、海马和小脑中PGRN、PSD95和SYN蛋白的表达情况。(3)TUNEL染色检测在上述时间点,各脑区神经元的凋亡情况。结果:1.VPA组大鼠额叶皮层和颞叶皮层的PGRN表达分别在PN14、35 d和PN7、14、35 d时显著高于CON组;海马和小脑的PGRN表达分别在PN35、72 d和PN14、35 d时较CON组减少。2.在PN7、14、35 d,VPA组大鼠额叶皮层神经元凋亡率与CON组无差异,但在PN72 d时较CON组增加;海马和小脑神经元凋亡率分别在PN35、72 d和PN14、35 d时较CON组增加。3.VPA组大鼠额叶皮层的PSD95和SYN表达在PN14、35 d高于、PN72 d低于CON组;颞叶皮层的PSD95表达在PN7、14、35 d均高于CON组,SYN表达在PN35、72 d高于CON组;海马的PSD95和SYN表达均在PN14、35、72 d时较CON组减少;小脑的PSD95表达在PN14、35 d时低于、PN72 d高于CON组,SYN表达在PN14、35 d时较CON组减少。结论:PGRN在VPA诱导的ASD大鼠神经系统发育的某些关键期和关键脑区表达水平的异常改变,可能扰乱神经元凋亡和突触发育的正常时空进程,这可能是孕期VPA暴露导致ASD患者神经功能障碍的重要原因。