丹参地上部分挥发油抗阿尔茨海默病作用研究

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目的:优化丹参地上部分挥发油提取工艺,分析丹参地上部分挥发油成分组成及其总萜类含量测定,体外抗氧化实验探究丹参地上部分挥发油抗氧化能力,最后通过体内AD小鼠模型药理实验,对丹参地上部分挥发油的抗AD活性及其作用机制进行探究。以期寻找新的潜在抗AD药,促进丹参植株资源的综合开发利用。方法:采用单因素实验设计和正交试验设计,优化水蒸气蒸馏法提取丹参地上部分挥发油提取工艺;以GC/GC-MS技术分析丹参地上部分挥发油成分组成,以α-石竹烯为对照品,用5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸的显色原理,建立丹参地上部分挥发油总萜类含量测定方法,对丹参地上部分挥发油总萜类含量进行测定;清除DPPH自由基、三氯乙酸还原法测定丹参地上部分挥发油体外抗氧化活性;采用腹腔注射D-gal和灌胃给药AlCl3的方法建造AD小鼠模型,探究丹参地上部分挥发油抗AD作用,分别从行为学水平上应用Morris水迷宫实验和探针试验测定实验AD模型小鼠的学习能力和空间记忆能力,从蛋白水平上应用蛋白印迹分析(WB)和免疫组化分析(IHC)测定小鼠脑内与AD发病相关的Aβ,GFAP,BACE-1和NEP含量,从分子生物学水平上用Biochemical determinations考察AD小鼠脑匀浆中MDA,ROS,SOD,GSH,AchE和Ach含量,从基因水平上应用RT-PCR技术考察AD小鼠脑内相关炎症因子和Aβ相关蛋白的表达变化。结果:利用正交实验优化水蒸气蒸馏法提取丹参地上部分挥发油提取工艺,确定最佳提取工艺条件为浸渍6h、蒸馏8h、料液比1:18g·ml-1,挥发油提取率为0.0935%。GC/GC-MS分析挥发油中化学成分组成,面积归一化法计算得出丹参地上部分挥发油中总萜类成分约占总挥发性的53.88%,其含量较高的萜类成分有β-石竹烯、β-石竹烯氧化物、二氢-新罗烯、大根香叶烯-D和α-石竹烯等,紫外分光光度法测得丹参地上部分挥发油中总萜类含量为72.38%,达到先前国家对5类新药的申报要求。体外抗氧化实验结果表明,与相当浓度的VC相比丹参地上部分挥发油具有较强的体外抗氧化能力。从个体行为学水平、分子生物学水平、蛋白水平和基因水平上考察丹参地上部分挥发油对由D-gal联合AlCl3引起的AD小鼠样症状,结果表明丹参地上部分挥发油可以明显提高小鼠的学习能力和记忆能力,显著性抑制小鼠大脑海马区和皮层区内与AD发病相关的Aβ、BACE-1和GFAP的表达能力,促进NEP在海马区和皮层区分布,Ach、GSH的含量和抗氧化酶SOD、CAT的活性明显升高,促进小鼠脑内炎性反应、氧化损伤相关炎性因子和Aβ生成相关酶的基因表达水平也都有所降低。结论:体内外药理实验证明,丹参地上部分挥发油具有较强的抗炎、抗氧化能力,对由D-gal联合AlCl3引起的AD小鼠样症状可以起到一定的缓解与治疗作用。从而为寻找天然抗AD药物提供了基础、思路与方法,对于促进综合开发利用丹参植物资源具有重要意义。
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