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脓毒症是临床ICU中常见的危重病症,其发生率和死亡率均很高。脓毒症早期即存在肠屏障功能障碍,它受损可直接导致肠通透性增加,细菌入血,从而加重脓毒症,这也是启动多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),甚至导致机体死亡的重要因素。因此,保护脓毒症肠屏障功能显得非常重要。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一类多能干细胞,具有多向分化潜能,也可通过旁分泌多种营养趋化因子参与损伤组织的修复。近年研究发现,MSC可治疗脓毒症,对脓毒症肝、心、肾、肺等器官都有保护作用。此外,在炎症性肠病、放射性肠损伤、缺血再灌注肠损伤等肠道疾病中,MSC也发挥了较好的肠屏障保护功能,但目前尚未见到MSC对脓毒症肠屏障功能保护及相关机制的报道。大量文献及临床研究实验发现,由于MSC仍有一定免疫原性,导致异体移植的MSC在机体存活时间短、存活数量有限,这限制了MSC的临床应用。聚肌苷酸胞苷酸Poly(I:C)是双链RNA类似物,Toll样3受体激动剂。有研究发现,Poly(I:C)不仅可增强MSC的迁移及免疫调节功能,降低MSC免疫原性,也可增强MSC旁分泌转化生长因子-β(Transforming growth factors,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)等多种生长因子的作用,从而增强MSC对肝、心等重要脏器的保护功能,但Poly(I:C)预刺激是否可增强MSC对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用,未见相关报道。据此,本实验采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)复制大鼠脓毒症模型,研究MSC及Poly(I:C)预刺激后对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用及机制。具体内容包含两部分:(1)MSC及Poly(I:C)预刺激后对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用;(2)MSC及Poly(I:C)预刺激后对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护机制。主要实验内容和方法:提取SD大鼠间充质干细胞并培养,取第3-5代用于后续治疗脓毒症大鼠及其他实验。观察处理后大鼠肠通透性、血D-Lac浓度、内毒素浓度;常规观察小肠病理形态学改变,并采用免疫组化观察肠紧密连接蛋白ZO-1表达;离体肠上皮细胞水平观察单层跨上皮电阻TER及紧密连接蛋白ZO-1表达;荧光标记MSC观察MSC在小肠黏膜分布情况,Elisa测定MSC旁分泌生长因子变化;MTT测定IEC-6增殖情况。主要研究结果:第一部分MSC及Poly(I:C)预刺激后对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用1、整体动物上,脓毒症大鼠肠屏障功能受损明显,表现为肠道对EB通透率明显增加,血D-Lac、内毒素浓度升高,肠组织紧密连接蛋白ZO-1表达降低,肠病理结构显示肠粘膜充血水肿,肠绒毛断裂,炎细胞、红细胞渗出明显;予以常规治疗后,脓毒症大鼠肠屏障功能得到一定的改善,肠病理显示红细胞渗出减少,炎症减轻,ZO-1表达上调,72h存活率有所上升;MSC联合常规治疗后,可明显改善脓毒症大鼠肠通透性,降低血中D-Lac及内毒素浓度,并改善脓毒症大鼠肠病理结构,起到对肠组织较好的修复作用,72h存活率明显增加,为37.5%;Poly(I:C)预刺激MSC可增强MSC对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用,主要表现在小肠对EB的通过率进一步减少,血中D-Lac及内毒素浓度显著降低,肠病理结构明显得到恢复,肠绒毛数量增加、红细胞渗出明显减少及紧密连接蛋白表达显著上升,72h存活率升至50%。2、离体肠上皮细胞水平上,LPS刺激后的IEC-6通透性(TER表示)显著降低,紧密连接蛋白ZO-1紊乱断裂表达下降明显;经MSC处理后,IEC-6通透性有所回升,紧密连接蛋白ZO-1表达开始规则连续;Poly(I:C)预刺激的MSC进一步改善了IEC-6的通透性,使ZO-1较为规则连续,表达明显增高。上述结果说明:MSC及Poly(I:C)预刺激后对脓毒症大鼠肠屏障功能具有明显的保护作用,且Poly(I:C)可增强MSC对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用。第二部分MSC及Poly(I:C)预刺激后对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用机制1、直接机制--MSC直接在肠粘膜定植参与受损肠组织修复(1)、整体动物水平上,通过腺病毒转染GFP标记MSC,发现MSC可在脓毒症大鼠肠粘膜定植参与修复;经Poly(I:C)预刺激后,有更多的MSC在肠粘膜定植。2、间接机制—MSC旁分泌生长因子参与受损肠组织修复(1)、MSC旁分泌生长因子变化通过对整体及离体水平上MSC旁分泌生长因子的检测,发现整体动物血中及MSC培养基上清液中,FGF、TGF-β、SDF-1α水平显著增加;经Poly(I:C)预刺激后,MSC对TGF-β、SDF-1α、FGF的旁分泌功能显著增强。(2)、MSC上清液可保护经LPS刺激后的IEC-6,改善肠上皮通透性。在离体水平上,分离MSC上清液,加入上清液后可改善LPS刺激后的IEC-6通透性,表现为TER值的上升及紧密连接蛋白ZO-1表达增加。测定IEC-6增殖情况,发现MSC上清液促进IEC-6增殖,而Poly(I:C)可增强MSC对IEC-6的保护作用。结论:1、MSC可保护脓毒症肠屏障功能,具体表现为MSC改善了脓毒症肠通透性(肠对EB透过率),降低血中D-Lac及内毒素浓度,并可修复受损肠组织,上调紧密连接蛋白ZO-1。2、Poly(I:C)预刺激能增强MSC对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用,表现为进一步改善肠通透性,降低血D-Lac及内毒素浓度,显著增强MSC对受损肠组织的修复。3、MSC发挥保护脓毒症肠屏障功能的主要机制有直接机制和间接机制。直接机制是MSC可通过在脓毒症大鼠受损肠黏膜定植参与修复,Poly(I:C)预刺激可增加MSC的定植数量;间接机制主要是MSC通过旁分泌生长因子TGF-β、FGF、SDF-1α上调紧密连接蛋白ZO-1表达并促进肠上皮的增殖从而发挥保护脓毒症肠屏障功能,Poly(I:C)预刺激增强了MSC旁分泌TGF-β、FGF、SDF-1α的功能从而更好的发挥保护肠屏障的作用。