儿童性早熟作为常见的儿科内分泌疾病,患儿多表现出与其实际年龄不相符的性特征发育。中枢性性早熟(Central Precocious Puberty, CPP)约占儿童性早熟病病例的80%,是临床诊断中儿童性早熟的主要类型。研究证实HPG轴的提前活化是CPP发病的根本原因, 下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal, HPG)轴激活后促性腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH)脉冲释放幅度的增加可使患儿促性腺激素和性激素的分泌水平上调,导致患儿生长线性速度加快,出现骨骼发育超前,身高生长显著等临床特点。在临床诊断中除了常见的中枢性性早熟外,还可见仅表现为单纯乳房或阴毛发育的不完全性性早熟(Incomplete Precocious Puberty, IPP),这一类性早熟患儿可见部分性特征提前发生且不伴有骨龄超前。IPP作为CPP变异型性早熟类型,患儿HPG轴仅发生部分提前激活,这也就使IPP病程并不会像CPP般持续性进展,某些患儿临床表征可自行消退不需进行临床治疗,但近年来发现部分IPP患儿可转化为CPP。因此两类性早熟疾病在治疗和病情跟踪方面应区别对待,如何对CPP和IPP进行鉴别诊断,提高早期诊断效率和准确性成为目前内分泌研究的热点之一。GnRH刺激试验作为区分CPP和IPP的诊断金标准,需住院后在短时间内对患者进行多次静脉穿刺收集血样,其不仅费用昂贵,还给患儿及家长带来极大的痛苦。而免疫化学发光测定技术的出现,可极大的提高HPG轴功能启动标志物,促黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)及卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone FSH)检测灵敏度,通过分析促性腺激素基础值即可对青春期前和青春期状态进行有效区分,可显著提高诊断效率。但仅通过LH或FSH基础值用于性早熟诊断可能导致假阳性或假阴性结果,因此需结合其他诊断指标以降低误诊几率。超声检查能直观的反应患者的生殖器官的变化,可实时无创对患者子宫、卵巢的形态、大小及其内部回声进行观察,为儿童性早熟提供客观准确的诊断依据。生长轴作为机体内一类重要的内分泌代谢轴,可通过与下丘脑、垂体及效应器官相互作用参与调控人类的生长发育过程,尤其是在胎儿到青春期启动过程中。胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1)作为重要的生长激素,不仅与骨骼发育密切相关,它还参与调控中枢神经系统及内分泌系统功能,HPG轴作为最重要的生殖发育内分泌系统,IGF-1可直接或间接的影响GnRH脉冲释放,因此IGF-1分泌水平可反映青春期启动时间。研究证实GnRH脉冲发生器过度激活所诱发的青春期提前启动是中枢性性早熟发生的根本原因,提示作为GnRH神经元调控因子IGF-1同样参与了性早熟发病过程。KISS1/GPR54-GnRH作为青春期激活的始动信号之一,大量体内及体外实验证实IGF-1可促进KISS1基因表达水平,提示KISS1/GPR54基因可能参与介导了IGF-1促GnRH脉冲释放过程,但对其介导的机制尚未明确。PI3K-AKT是经典的调控细胞增殖、分化及凋亡信号,研究证实PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)可被IGF-1受体激活后参与HPG轴功能的调控,且PI3K-AKT (蛋白激酶B)信号的过度激活可导致卵巢的提前发育。由此我们推测PI3K-AKT可能介导IGF-1对KISS1/GPR54表达的调控,并参与GnRH脉冲发生的活化过程。因此本研究中,我们首先对比了中枢性性早熟和不完全性性早熟患儿外周血中促性腺激素含量、性激素水平、子宫和卵巢B超诊断结果,探讨了二者在检测结果上的差异性,旨在为今后中枢性性早熟和不完全性性早熟的临床诊断提供可靠依据。其次,通过体外实验探讨IGF-1是否通过PI3K/AKT介导作用影响KISS1/GPR54表达进而实现对GnRH脉冲分泌的调控,为今后IGF-1的基础研究和临床应用提供实验依据。最后,分析两组患儿外周血的IGF-1水平与影像学指标等的相关性,表明影像学联合IGF-1在儿童性早熟疾病诊断中具有重要的临床应用价值。研究目的明确CPP和IPP患儿骨龄、超声诊断、性激素及IGF-1检测指标的差异；探讨IGF-1对KISS1/GPR54表达影响及可能机制；分析CPP和IPP患儿IGF-1水平与影像学指标及性激素指标的相关性。研究方法1.收集2013年-2015年就诊于我院儿科内分泌门诊的具有完整资料的CPP及IPP女童各40例作为研究对象。CPP组患儿初诊时平均年龄为1～11岁,平均年龄(7.75±2.43)岁,IPP组患儿初诊时年龄为2～9岁,平均年龄为(7.50±1.64)岁,所有患儿经详细询问病史、体格检查、子宫卵巢B超扫描、骨龄检查、测定性激素及IGF-1水平,所有患者均知情并签署知情同意书。2.分析比较CPP和IPP患儿骨龄、超声诊断、性激素及IGF-1检测指标的差异。3.分离培养SD乳鼠下丘脑神经元,分别给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预2h,4h,6h及24 h后,放免法检测不同处理时间下SD乳鼠下丘脑神经元培养上清液中GnRH含量,明确最佳的作用时间；实时荧光定量PCR测定IGF-1干预后下丘脑神经元KISS1、GPR54及GnRH mRNA表达水平,western blot检测IGF-1干预后下丘脑神经元AKT及p-AKT蛋白表达水平；使用P13K抑制剂LY294002预处理30 min后,在培养液上清中加入10 ng/ml IGF-1处理4 h,实时荧光定量PCR分析下丘脑神经元KISS1、GPR54mRNA表达水平。4.分析CPP和IPP患儿IGF-1水平与影像学指标及性激素指标的相关性。研究结果1.CPP及IPP患儿临床指标差异性分析1)CPP组患儿的平均骨龄为(9.19±2.73)岁,骨龄范围为2-12岁,与实际年龄相比,骨龄明显偏大(P<0.05),二者之差为1.70岁,符合中枢性性早熟诊断标准中骨龄应大于实际年龄1岁以上的要求。IPP组患儿平均骨龄为(8.08±1.97)岁,骨龄范围为1.5-9岁,与实际年龄之差为0.52岁,基本与实际年龄相符合。对比CPP组与IPP组患儿的骨龄,可见CPP组患儿的骨龄明显高于IPP组(P<0.05)。骨龄指数计算公式=骨龄／实际年龄,CPP组和IPP组骨龄指数计算结果分别为1.25±0.26和1.07±0.23,差异具有统计学意义(P<0.05)。2)CPP组患儿子宫容积和宫颈长度分别为2.90±2.99 ml和1.76±0.26 cm,IPP组患儿子宫容积和宫颈长度为1.52±0.94 ml和1.78±0.61cm,对比两组数据可见CPP患儿子宫容积明显高于IPP组(P<0.05),但宫颈长度两组间无明显差异；对比两组患儿卵巢超声诊断指标,在卵巢容积方面CPP组与IPP组患儿而没有明显的差别,但CPP组患儿卵巢中卵泡最大直径为0.59±0.23 cm,明显高于IPP组(P<0.05),且CPP组直径大于0.4 cm卵泡个数为3.63±2.35个,而IPP组患儿直径大于0.4 cm卵泡个数为2.34±1.38个,与CPP组相比,IPP组患儿卵巢中直径大于0.4 cm卵泡个数明显减少(P<0.05)。上述结果表明与IPP患儿相比,CPP患儿的子宫容积及卵巢中最大卵泡直径明显增加,直径大于0.4 cm卵泡个数显著增多,提示CPP患儿子宫及卵巢成熟度高于IPP患儿。3)CPP及1PP患儿血清中FSH含量分别为5.04±4.17 IU/L和1.30±0.48 IU/L,LH含量为1.97±2.49 IU/L和0.50±0.32 IU/L,E2含量分别为24.32±26.92 pg/ml和13.06±8.49pg/ml,T含量分别为0.18±0.19ng/ml和0.09±0.10pg/ml, CPP组患儿血清中FSH、LH、E2和T的水平明显高于IPP组,差异有统计学意义(P<0.05)；以上结果提示CPP患儿性腺轴活化程度较高。4)CPP组和IPP组患儿血清中IGF-1含量分别为318.94±155.81 ng/ml和191.46±107.89ng/ml,CPP组患儿IGF-1含量明显高于IPP组。2.IGF-1对SD幼鼠下丘脑神经元原代细胞KISS1/GPR54表达影响及机制研究1)SD乳鼠下丘脑神经元给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预2 h后,培养上清液中GnRH含量分别为13.63±3.56 pg/ml和19.17±3.12pg/ml,表明IGF-1干预2 h后培养上清中GnRH含量即开始增加(p<0.05)；培养4 h后,IGF-1干预组GnRH含量继续增加,提示IGF-1可增强SD乳鼠下丘脑神经元GnRH分泌能力；培养6 h后,10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预组培养上清液中GnRH含量均出现不同程度的降低,此时10 ng/ml IGF-1干预组中GnRH含量已与对照组水平相当；24 h后IGF-1干预组培养上清液中GnRH含量继续降低,尤其是100ng/ml IGF-1干预组,其培养上清液中GnRH含量为8.79±2.07 pg/ml,明显低于对照组(p<0.05),上述结果表明,经不同浓度IGF-1处理后,SD乳鼠下丘脑神经元培养上清液GnRH含量呈现先升高后下降的趋势,IGF-1干预4 h时上清液中GnRH水平达到峰值随后进入下降阶段,因此在后续研究我们设置4 h作为实验干预时间。2)给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预4 h后,SD乳鼠下丘脑神经元KISS1及GPR54 mRNA表达水平均显著升高(p<0-05),且存在剂量依赖性,提示IGF-1可上调下丘脑神经元KISS1和GPR54 mRNA表达。3)给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预4 h后,SD乳鼠下丘脑神经元GnRH mRNA表达水平表现为不同程度的升高,且与对照组存在显著性差异(p<0.05),其改变情况与培养上清中GnRH分泌水平变化相一致。4)给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预4 h后,Western-blot法测定下丘脑神经元AKT及p-AKT蛋白表达,可见与对照组相比,IGF-1干预组AKT蛋白表达水平未发生明显改变,但IGF-1可显著上调下丘脑神经元p-AKT蛋白表达水平(p<0.05),提示IGF-1可激活PI3K-AKT信号通路。5)经LY294002预处理后,给予10ng/ml IGF-1干预4 h,可见下丘脑神经元p-AKT蛋白表达水平明显降低(p<0.05)。6)LY294002预处理可使IGF-1干预组中下丘脑神经元KISS1和GPR54 mRNA表达水平下调,提示LY294002可拮抗IGF-1对KISS1/GPR54mRNA的促表达作用。3.CPP及IPP患儿血清IGF-1水平与骨龄、超声及性激素指标相关性分析1)CPP和IPP组患儿血清中IGF-1水平与骨龄指数呈明显相关性。2)CPP组患儿血清中IGF-1含量与子宫容积、卵巢体积及卵泡数目呈显著正相关性(P<0.05);IPP组患儿血清中IGF-1含量与子宫容积、卵巢体积及卵泡数目无明显相关性。3)CPP组患儿血清中IGF-1含量与LH、E2、及T呈显著正相关性(P<0.05),与FSH、PRL、PRG无明显相关性；IPP组患儿血清中IGF-1含量与T呈显著正相关性(P<0.05),与FSH、LH、E2、PRL、PRG无明显相关性。结论1)CPP患儿骨龄指数大于IPP患儿组,在超声指标方面,CPP患儿子宫体积、最大卵泡直径及直径>0.4 cm卵泡数目均明显高于IPP患儿组,提示骨龄及超声检查在中枢性性早熟和不完全性性早熟的鉴别诊断中有较高的应用价值；CPP患儿外周血中FSH、LH、E2、T及IGF-1水平均高于IPP患儿组,性激素及IGF-1可作为辅助指标用于中枢性性早熟和不完全性性早熟的鉴别诊断。2) IGF-1可通过激活PI3K/AKT信号上调SD乳鼠下丘脑神经元KISS1和GPR45 mRNA表达水平。3)IGF-1与CPP患儿性激素、性腺发育表现为正相关性,表明IGF-1参与调控青春期启动发生。