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研究背景及目的肝癌严重威胁人类健康,深入探讨肝癌发病的分子机制,可为肝癌的防治提供新思路。Hsp90(Heat shock protein 90)作为真核细胞中不可或缺的分子伴侣,参与调控复杂的蛋白质稳态系统,是抗癌药物研发的明星分子。已有研究发现Hsp90在多种肿瘤组织中过量表达,且肝癌组织中Hsp90的表达与肿瘤的分化程度以及肿瘤大小密切相关。低氧应激在实体瘤中普遍存在,并能诱发细胞自噬。自噬与肿瘤细胞存活、增殖及肿瘤转移密切相关。TFEB(transcription factor EB)是细胞自噬相关过程中的重要转录因子,在多种疾病的发生发展中起着重要作用,是心血管疾病,神经退行性疾病,肿瘤等治疗的潜在靶点。本文旨在探讨热休克蛋白90对人肝癌细胞自噬相关转录因子EB的调控机制。目的:1.探讨不同浓度的Hsp90 N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin对肝癌细胞HepG2细胞活力的影响;2.探讨低氧应激环境对肝癌细胞HepG2中Hsp90和TFEB蛋白表达水平的影响;3.探讨Hsp90 N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin对肝癌细胞HepG2中TFEB及TFEB下游分子LC3,P62蛋白表达水平的影响;4.探讨分别在野生型HepG2细胞(HepG2WT)、Hsp90α敲除的HepG2细胞(HepG2 KO)中瞬时转染全长Flag-Hsp90α表达质粒对TFEB蛋白表达水平的影响;5.探讨Hsp90抑制剂STA9090影响了 TFEB的蛋白合成过程还是蛋白降解过程;6.探讨Hsp90抑制剂STA9090对TFEB转录水平的影响;7.探讨Hsp90是否结合在TFEB的启动子区域以及具体结合位置。方法:1.分别给予不同浓度的Hsp90 N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin处理肝癌细胞HepG2,用MTT法检测细胞活力;2.在常氧和低氧条件下,Western Blot法(蛋白免疫印迹实验)检测0.1 μmol/L 的 Hsp90 的 N 端抑制剂 STA9090,0.5mmol/L 的 C 端抑制剂 Novobiocin对TFEB及其下游自噬相关基因LC3,P62蛋白表达水平的影响;3.在常氧和低氧条件下,Western Blot法(蛋白免疫印迹实验)检测不同浓度梯度的Hsp90抑制剂STA9090对TFEB蛋白表达水平的影响;4.97H高迁徙性肝癌细胞经皮下注入SPF级裸鼠,成瘤后解剖裸鼠,取出瘤体组织切片进行免疫组化实验,检测STA9090处理组TFEB蛋白的表达情况;5.分别在野生型HepG2细胞(HepG2 WT)、Hsp90α敲除的HepG2细胞(HepG2 KO)中瞬时转染全长Flag-Hsp90α表达质粒,Western Blot法检测TFEB蛋白表达水平;6.用STA9090(Hsp90抑制剂),CHX(蛋白生物合成抑制剂,用于抑制蛋白翻译),MG132(蛋白酶体抑制剂,用于抑制蛋白降解)设置不同的加药组合,Western Blot法(蛋白免疫印迹实验)检测TFEB蛋白表达水平;7.常氧和低氧条件下,RT-PCR 法(Reverse Transcription PCR)检测 Hsp90抑制剂STA9090对TFEB mRNA表达水平的影响;8.应用染色质共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)观察 Hsp90的N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin对Hsp90与TFEB的近启动子区结合能力的影响;9.构建三种含TFEB近启动子区不同位点的双荧光素酶报告基因质粒,转染至肝癌细胞HepG2,用双荧光素酶报告基因实验探究Hsp90在TFEB近启动子区的结合位置,并佐证ChIP中Hsp90抑制剂对Hsp90与TFEB近启动子区结合能力的影响。结果:1.MTT法检测结果显示:与对照组相比,Hsp90的N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin处理肝癌细胞HepG2达24 h后,细胞活力下降(p<0.05),分别在一定范围内,随STA9090,Novobiocin剂量的增加,细胞活力逐渐下降,STA9090 和 Novobiocin 的 IC50 分别为 0.1μmol/L、0.5mmol/L;2.Western Blot法(蛋白免疫印迹实验)结果显示:在常氧和低氧条件下,Hsp90的N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin处理肝癌细胞HepG2,TFEB和LC3、P62的蛋白表达水平均下降;3.Western Blot法(蛋白免疫印迹实验)结果显示:在常氧和低氧条件下,Hsp90抑制剂STA9090下调TFEB蛋白表达水平,并存在浓度依赖性;4.免疫组化结果显示:STA9090处理裸鼠后,瘤体组织内TFEB蛋白的表达情况水平下降;5.Western Blot法(蛋白免疫印迹实验)结果显示:分别在野生型HepG2细胞(HepG2 WT)、Hsp90α敲除的HepG2细胞(HepG2 KO)中瞬时转染全长Flag-Hsp90α表达质粒24h,TFEB蛋白表达水平均上升;6.Western Blot法(蛋白免疫印迹实验)结果显示:Hsp90抑制剂STA9090导致的TFEB蛋白表达水平下降是由于TFEB的蛋白合成过程被抑制,而并非促进了 TFEB蛋白降解过程;7.RT-PCR法(Reverse Transcription PCR)结果显示:常氧和低氧条件下,Hsp90抑制剂STA9090下调TFEB mRNA表达水平;8.ChIP 实验(Chromatin Immunoprecipitation,染色质免疫共沉淀)证明Hsp90结合于TFEB近启动子区(碱基序列在-179~-57的启动子区域),参与调控其转录过程,Hsp90 N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin抑制其结合能力;9.双荧光素酶报告基因实验证明TFEB近启动子区(-500~0)区域是调控TFEB转录的重要位点,Hsp90 N端抑制剂STA9090,C端抑制剂Novobiocin下调TFEB的转录水平。结论:1.Hsp90抑制剂诱导TFEB及其下游自噬相关靶基因LC3、P62的表达水平均降低;低氧应激诱导TFEB及其下游自噬相关靶基因LC3、P62的表达水平均升高;2.Hsp90对TFEB具有调控作用,调控的是TFEB的蛋白合成过程而非降解过程,并且调控的是TFEB蛋白合成过程中TFEB的转录水平;3.Hsp90对TFEB转录水平调控是通过Hsp90结合在TFEB启动子区域来实现的,进而影响TFEB的转录活性。Hsp90结合在TFEB启动子区(-500~0)的DNA序列区域。